Technicalregulationofmedicinalplantcellculture中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布I 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。大連普瑞康生物技術(shù)有限公司、廣西藥用植物園、安徽中醫(yī)藥大學(xué)、大連源盛泰醫(yī)療投資股份有限公本文件主要起草人：黃璐琦、劉漢石、袁媛、劉雅萍、秦雙雙、劉禹、李曉琳、謝冬梅、陳梓、金銀兵、趙玉洋、張顯林、周駿輝、吳俊罡、趙喬、黃利、張利用生物技術(shù)保護(hù)模式獲取中藥材補(bǔ)充資源，是解決我國(guó)珍稀瀕危藥用植物資源日趨枯竭、市場(chǎng)需求卻日益強(qiáng)勁這一矛盾的有效途徑。藥用植物高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞是指在人工控制條件下高密度大量培養(yǎng)的藥用植物細(xì)胞，具有成分清楚、功效明確、質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)。作為一種生物技術(shù)補(bǔ)充資源，藥用植物高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究，并成為新食品、保健品、化妝品1藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中工作區(qū)條件、清洗與滅菌、試劑與培養(yǎng)基、培養(yǎng)與保存的本文件適用于苔蘚植物、蕨類植物、種子植物中的藥用植物細(xì)胞下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和LY/T1882—2010林木組織培養(yǎng)育DB33/T752—2022植物種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)medicinalplantc在無菌條件下，將經(jīng)過表面消毒處理的外植體切割后轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上的過2外植體經(jīng)初代培養(yǎng)后，經(jīng)過若干次轉(zhuǎn)接于新培養(yǎng)基上，并持續(xù)4工作區(qū)條件4.1概述工作區(qū)一般由洗滌間、消毒間、培養(yǎng)基制備間、緩沖間、接種間、培養(yǎng)間和細(xì)胞保存4.2洗滌間配置水槽、工作臺(tái)等，地面應(yīng)防水、防滑，水槽處墻面應(yīng)4.3消毒間配置排風(fēng)及滅火設(shè)備，配備高壓蒸汽消毒器、鼓風(fēng)干燥箱等設(shè)備。工作規(guī)模較小或空間有限時(shí)，4.4培養(yǎng)基制備間應(yīng)有適宜空間及配套工作臺(tái)，配置存放化學(xué)試劑的藥品柜、危險(xiǎn)品柜及存放培養(yǎng)、接種器皿的器械柜，并配備電子天平、超純水裝置、磁力攪拌器等設(shè)4.5接種間手池、更衣柜等。接種間門窗應(yīng)密封防塵，地面和墻壁平整光滑，便于清潔和消毒；配備空調(diào)、除濕機(jī)、溫濕度測(cè)量裝置，以控制培養(yǎng)溫度、濕度；配4.6培養(yǎng)間必要可配備一個(gè)通氣窗，并安裝排風(fēng)扇；配備光照控制系統(tǒng)、紫外燈、光照培養(yǎng)架、暗培養(yǎng)柜（或培4.7細(xì)胞保存間35清洗與滅菌5.1.1普通器皿及器械清洗普通器皿和器械的清洗包括浸泡、刷洗、沖洗、干燥四個(gè)步a）浸泡：用洗滌劑（肥皂水、洗潔精等）浸泡6h～24h；5.1.2初次使用器皿及器械清洗燥后用1％鹽酸浸泡30min，再?zèng)_洗、干5.1.3污染器皿及器械清洗洗不掉的嚴(yán)重污垢應(yīng)置于4％的重鉻酸鉀洗液浸泡4h～24h，再按照5.1.1進(jìn)行沖洗、干燥。5.2.1器皿和器械滅菌塑料和橡膠材質(zhì)的器具應(yīng)在0.073MPa5.2.2培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌分為高壓蒸汽滅菌和過濾除菌。過濾除菌，也可將熱不穩(wěn)定的成分單獨(dú)溶解后過濾除菌，再添加到經(jīng)過高壓蒸5.2.3外植體表面滅菌4Mn和Zn等微量元素，配制濃度通常為微摩爾每升數(shù)量級(jí)。碳水化合物常用蔗糖，也可選用葡葡糖、麥芽糖、果糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露糖等，還b）細(xì)胞分裂素：激動(dòng)素（KT）、6-芐基嘌呤（6-BA）、玉米素（Zc）胚乳液：椰子乳汁、玉米胚乳和其他禾本科、根據(jù)培養(yǎng)基配方，分別配制無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、維生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、有機(jī)附加成分母液。母液母液。母液一般在2℃~4℃保存，保存期應(yīng)不超過15天，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液保存期不超過605滅菌后的培養(yǎng)基常溫下保存一般不超過7天，2℃~4℃條件下保存一般不超過14天。選擇的外植體包括：藥用植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等器官，如根的根尖和切段，莖的木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、薄壁組織、髓部等，以及已誘導(dǎo)的愈傷組織；單個(gè)游離細(xì)刀、鑷、剪等接種器械應(yīng)先用70％的乙醇將經(jīng)過滅菌的外植體置于器皿中，切除其外部邊緣，并切成尺寸適中、大小相對(duì)均一的小塊（通常小于1cm然后平鋪或斜插接種到培養(yǎng)基上。接種時(shí)接種器械應(yīng)在接種器皿的斜上方后的外植體要和培養(yǎng)基接觸良好，深淺適中，分布均勻，芽體應(yīng)露出培養(yǎng)基。接種后及時(shí)封好瓶口以6避免染菌。藥用植物細(xì)胞和原生質(zhì)體懸浮液直接轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中。愈傷組織可切成尺寸適中、大小相光照強(qiáng)度和光周期。通常培養(yǎng)室的相對(duì)濕度為60％，培養(yǎng)溫度為23℃~28℃。光周期可為光照、黑鏡下觀察為單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)，即為初代培養(yǎng)的經(jīng)初代培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)接種到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)、擴(kuò)繁。挑選生長(zhǎng)旺盛、結(jié)構(gòu)疏松的新鮮愈傷組織作為繼代培養(yǎng)的“種子”。繼代培養(yǎng)的時(shí)間間隔由藥用植物細(xì)胞的生長(zhǎng)速度決定。繼代培養(yǎng)包括固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、飼養(yǎng)層培養(yǎng)和雙層濾紙植板獲得穩(wěn)定