八、液相色譜法1

第七章液相色譜

§7-1概述（1）液相色譜簡介（2）液相色譜的發展（3）液相色譜的分類§7-2液相色譜儀（1）液相色譜儀（2）液相色譜儀的流程圖（3）液相色譜儀的工作過程（4）液相色譜儀的基本組成系統（5）高壓泵八、液相色譜法2第七章液相色譜(liquidchromatography)（6）梯度洗脫裝置（7）進樣器（8）色譜柱（9）色譜填料（10）檢測器（11）數據處理系統與自動控制單元§7-3新型液相色譜儀簡介（1）waters的UPLC（2）島津高效率HPLC-2010A/2010C型（3）島津LC-VP系列應用系統離子色譜儀§7-4液相色譜的應用八、液相色譜法3第七章液相色譜(liquidchromatography)

八、液相色譜法4第七章

液相色譜

(liquidchromatography)

§7-1概述八、液相色譜法5第七章

液相色譜(liquidchromatography)

§7-1概述

（1）液相色譜簡介液相色譜是以液體為流動相的色譜分析方法。英文縮寫：LC。按其固定相的不同，又可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）八、液相色譜法6第七章

液相色譜(liquidchromatography)

§7-1概述

（2）液相色譜的發展在所有色譜技術中，液相色譜法是最早（1903年）發明的，但其初期發展較慢，在液相色譜普及之前，紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。到了20世紀60年代后期，將已經發展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術應用到液相色譜上來，使液相色譜得到了迅速的發展。特別是填料制備技術、檢測技術和高壓輸液泵性能的不斷改進，使液相色譜分析實現了高效化和高速化。具有這些優良性能的液相色譜儀于1969年商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱為高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），也稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法。

八、液相色譜法7A：

高效液相色譜與經典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大增加，分析速度極快，只需數分鐘；而經典方法靠重力加料，完成一次分析需時數小時。高效：填充物顆粒極細且規則，固定相涂漬均勻、傳質阻力小，因而柱效很高。可以在數分鐘內完成數百種物質的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測器——10-11g。B：.HPLC與GC的比較分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩定化合物，而這些物質只點有機物總數的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩定或不穩定化合物，這類物質占有機物總數的80%。流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。八、液相色譜法8第七章

液相色譜(liquidchromatography)

§7-1概述

（3）液相色譜的分類廣義地講，固定相為平面狀的紙色譜法和薄層色譜法也是以液體為流動相，也應歸于液相色譜法。不過通常所說的液相色譜法僅指所用固定相為柱型的柱液相色譜法。

通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。但有些液相色譜方法并不能簡單地歸于這四類。

第七章

液相色譜(liquidchromatography)

§7-1概述

（3）液相色譜的分類類型主要分離機理主要分析對象或應用領域吸附色譜吸附能，氫鍵異構體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機離子、有機離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質分離與純化手性色譜立體效應手性異構體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫藥分析表7－1液相色譜分類八、液相色譜法10兩種最常用的色譜法（一）吸附色譜法（adsorptionchromatography）

以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法。使用最多的吸附色譜固定相是硅膠，流動相一般使用一種或多種有機溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。組分的極性越大、固定相的吸附力越強，則保留時間越長。流動相的極性越大，洗脫力越強，則組分的保留時間越短。

八、液相色譜法11

液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑，分離時，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數（K)的不同而被分離。目前廣泛使用的化學鍵合固定相是將固定液的官能團鍵合在載體上而制成的，使用化學鍵合固定相的色譜方法（簡稱鍵合相色譜法）可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位，是應用最廣的色譜法。

按照固定相和流動相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。（二）液-液分配色譜法（liquid-liquidchromatography)

八、液相色譜法121.正相色譜法（normalphasechromatography)

固定相極性大于流動相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法，簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動相一般為極性較小的有機溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于K值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質的分離。

八、液相色譜法13

流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法，簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動相中有機溶劑的比例增加，流動相極性減小，洗脫力增強。反相色譜法是目前應用最廣的高效液相色譜法。

2.反相色譜法（reversedphasechromatography）八、液相色譜法14第七章

液相色譜

(liquidchromatography)§7-2液相色譜儀返回八、液相色譜法15第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（1）液相色譜儀現在的液相色譜儀一般都做成一個個單元組件，然后根據分析要求將各個所需單元組件組合起來。最基本的組件是高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和數據系統（記錄儀、積分儀或色譜工作站）。此外，還可根據需要配置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進樣系統、柱后反應系統和全自動控制系統等。八、液相色譜法16第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（2）液相色譜儀的流程圖圖7－1液相色譜儀的流程圖八、液相色譜法17第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（3）液相色譜儀的工作過程輸液泵將流動相以穩定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進樣器將樣品導入,流動相將樣品帶入色譜柱,在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數或吸附力大小的不同而被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至數據系統記錄、處理或保存。八、液相色譜法18第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（4）液相色譜儀的基本組成系統1.流動相的流路系統（高壓輸液系統：儲液器、混合室、高壓泵、過濾器、壓力脈動阻力器、梯度洗脫裝置等組成。核心：高壓輸液泵）2.進樣系統：進樣器（微量注射器或六通閥）3.分離系統：色譜柱4.檢測系統：示差折光、紫外-可見、熒光、極譜、紅外等。5.信號放大記錄系統八、液相色譜法19第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（5）高壓泵

高壓輸液泵是液相色譜儀的關鍵部件，其作用是將流動相以穩定的流速或壓力輸送到色譜系統。對于帶在線脫氣裝置的色譜儀，流動相先經過脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩定性直接關系到分析結果的重復性和準確性。通常要求高壓泵具有：流量可調、耐高壓、液流穩定、死體積小等特點。輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析來說，輸液泵的流量穩定性更為重要，這是因為流速的變化會引起溶質的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據之一。因此，恒流泵的應用更廣泛。八、液相色譜法20第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（6）梯度洗脫裝置在進行多成分的復雜樣品的分離時，經常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內全部洗脫并達到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術。在液相色譜中流速（壓力）梯度和溫度梯度效果不大，而且還會帶來一些不利影響，因此，液相色譜中通常所說的梯度洗脫是指流動相梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。八、液相色譜法21第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（7）進樣器進樣器是將樣品溶液準確送入色譜柱的裝置，分手動和自動兩種方式。進樣器要求密封性好，死體積小，重復性好，進樣時引起色譜系統的壓力和流量波動要很小。除使用自動進樣裝置外，現在的液相色譜儀所采用的手動進樣器幾乎都是耐高壓、重復性好和操作方便的六通閥進樣器，實現了常壓下不停流進樣。八、液相色譜法22

六通進樣閥可分為定子和轉子兩部分，共有6個口，故稱為六通進樣閥。轉子通過扳手調節，可以分別處于“裝樣”和“進樣”兩個位置。圖中a為進樣閥處于“裝樣”位置的情況，此時流動相直接進入色譜柱，樣品注入口與樣品環連接，用微量進樣針將一定體積的樣品溶液從樣品注入口注入，裝于樣品管內。當將扳手扳至“進樣”位時，進樣閥的流路發生了改變，流動相通過樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進行分析。六通進樣閥具有使用方便，進樣量準確等優點。樣品環有10μl、20μl、50μl等不同容積，可以選配。樣品環不僅可以用來貯液，也可用來測量樣品溶液的體積。將樣品環裝滿后，進樣，進樣量即為樣品環的容積，此種進樣方式稱為“滿環進樣”或“定量環進樣”。用定量環進樣精密度好，在使用外標法時，應使用此種操作方式。

八、液相色譜法23六通進樣閥結構如圖所示：八、液相色譜法24第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（8）色譜柱色譜柱是實現分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩定。柱性能與柱結構、填料特性、填充質量和使用條件有關。色譜柱：是將色譜填料填充到色譜柱管中所構成的。色譜柱管：內部拋光的不銹鋼管。色譜往長一般10～30cm，內徑2～5mm。典型的液相色譜分析柱尺寸是內徑4.6mm，長250mm。色譜柱的填充干法填充：在硬臺面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50～100mg填料，然后在臺面上墩10～20次。濕法填充：使用專門的填充裝置進行填充。八、液相色譜法25第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（9）色譜填料色譜填料：經過制備處理后，用于填充色譜柱的物質顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。色譜填料基質：又常稱作載體或擔體，通常制備成數微米至數十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對分離不起明顯的作用，只是作為功能基團的載體。常用來作基質的有硅膠和有機高分子聚合物微球功能層：是通過化學或物理的方法固定在基質表面的、對樣品分子的保留起實質作用的有機分子或功能團。

化學鍵合相是廣泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilylsilicagel，ODS）的應用最為廣泛，ODS為非極性化學健合相，此外還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等，非極性化學健合相用于反相色譜法八、液相色譜法26第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（10）監測器檢測器：

用來連續監測經色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。檢測器利用溶質的某一物理或化學性質與流動相有差異的原理，當溶質從色譜柱流出時，會導致流動相背景值發生變化，從而在色譜圖上以色譜峰的形式記錄下來。

表§7-2常用的液相色譜監測器檢測器檢測下限/(g/ml)線性范圍主要特點紫外-可見光10－10103～

104對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很小；對溶質的響應變化大。示差折光10－1104可檢測所有物質；不適合微量分析；對溫度變化敏感熒光10－12～

10－11103選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響。化學發光10－13～

10－12103靈敏度高；發光試劑受限制；易受流動相組成和脈動的影響。電導10－2103～

104是離子性物質的通用檢測器；受溫度和流速影響；不能用于有機溶劑體系。質譜10－10主要用于定性和半定量。原子吸收光譜10－13～

10－10選擇性高。等離子體發射光譜10－2～

10－10可進行多元素同時檢測。八、液相色譜法28常用檢測器：紫外檢測器

應用最廣，對大部分有機化合物有響應。

(1)普通紫外檢測器

紫外檢測器是高效液相色譜中應用最廣的一種檢測器。用一定波長的單色光照射流通池，流動相攜帶被分離的組分進入流通池時，流動相在測定波長處不吸收光或吸收很弱，測

定組分在該波長處有很強的吸收，記錄不同時間對光的吸收度，就得到一張色譜圖。組分光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色譜峰的面積和組分的量成正比關系。紫外檢測器的特點是靈敏度高，線性范圍寬，對溫度和流動相的波動不敏感，可用于梯度洗脫。但紫外檢測器只能檢測具有紫外吸收的組分，像糖類、脂肪酸類等在測定范圍內無紫外吸收的組分不能檢側。用普通紫外檢側器也不便測定流出組分的紫外吸收光譜，有的紫外檢測器雖可測

定紫外吸收光譜，但在組分到達檢測器時需停流，再掃描。

八、液相色譜法29八、液相色譜法30(2)光二極管陣列檢瀏器(photodiodearraydetector，PDAD）

光二極管陣列檢測器是20世紀80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以在瞬間完成對組分的紫外掃描。1024個二極管陣列，各檢測組分特定波長，在190～800nm范圍內掃描，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。

八、液相色譜法31光電二極管陣列檢測器圖譜三維光譜-色譜圖

八、液相色譜法32八、液相色譜法33第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-2液相色譜儀

（11）數據處理系統與自動控制單元數據處理系統：

又稱色譜工作站。它可對分析全過程（分析條件、儀器狀態、分析狀態）進行在線顯示，自動采集、處理和儲存分析數據。自動控制單元：將各部件與控制單元連接起來，在計算機上通過色譜軟件將指令傳給控制單元，對整個分析實現自動控制，從而使整個分析過程全自動化。也有的色譜儀沒有設計專門的控制單元，而是每個單元分別通過控制部件與計算機相連，通過計算機分別控制儀器的各部分。圖7－2島津色譜儀用工作站返回八、液相色譜法34第七章

液相色譜

(liquidchromatography)§7-3新型液相色譜儀簡介返回八、液相色譜法35第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-3新型液相色譜儀簡介

（1）waters的UPLC超高效液相色譜是分離科學中的一個全新類別，它給實驗室帶來了新奇而強大的能力。UPLC?借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。ACQUITYUltraPerformanceLC?

系統的整體設計可以控制并優化所有的參數，以充分實現今天實驗室中UPLC技術所能帶來的任何利益。圖7－3waters的UPLC八、液相色譜法36第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-3新型液相色譜儀簡介

（2）島津高效率HPLC-2010A/2010C型通過高速進樣及多樣品處理大幅提高了分析效率的一體型HPLC。如果使用自動啟動、停機功能、自動有效性功能，則可實現分析、管理自動化，進一步提高了生產效率。另外，圖解式畫面和魔塊功能使操作更為便利。圖7－4島津高效率HPLC-2010A/2010C型八、液相色譜法37第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-3新型液相色譜儀簡介

（3）島津LC-VP系列應用系統離子色譜儀與先進的自動抑制器組合，進一步發揮出離子色譜儀的性能，可進行超高靈敏度的離子分析。另外，還可構成高穩定性，操作簡便的非抑制型離子色譜儀。圖7－5島津LC-VP系列應用系統離子色譜儀返回八、液相色譜法38第七章

液相色譜

(liquidchromatography)

§7-4液相色譜的應用返回

幾乎在所有學科領域都有廣泛應用，可以用于絕大多數物質成分的分離分析，它和氣相色譜都是應用最廣泛的儀器分析技術。

應用領域分析對象舉例環境常見無機陰陽離子、多環芳烴、多氯聯苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態、除草劑、農藥、酸沉降成分。農業土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農產品中無機和有機成分。化工無機化工產品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。食品無機陰陽離子、有機酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烴。生物氨基酸、多肽、蛋白質、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。醫藥人體化學成分、各類合成藥物成分、各種天然植物和動物藥物化學成分。第七章液相色譜(liquidchromatography)

§7-4液相色譜的應用表7-3液相色譜的應用返回八、液相色譜法40舉例：HPLC在藥物分析中的應用

高效液相色譜法分離效能高，應用范圍廣，靈敏度高，儀器已較成熟、普及，在新藥的研究開發，藥品檢驗，生物樣品的分析中應用十分廣泛。

（一）色譜系統適用性試驗

由于色譜分離的效果受色譜柱的狀況，流動相組成等因素的影響很大，為保證測定結果的準確，中國藥典規定，在進行色譜分析前需檢查色譜系統是否正常，是否符合要求，即需要作色譜系統適用性試驗，色譜系統適用性試驗的內容有：

八、液相色譜法411.色譜柱的理論板數

在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液記錄色譜圖，量出測定組分或內標物質峰的保留時間tR和半高峰寬Wh/2，按下式計算色譜往的理論板數：

n=5.54(tR/Wh/2)2

如果測得理論板數低于各品種項下的規定，應更換色譜柱或其他條件使理論板數達到要求。

色譜柱的理論板數主要取決于半高峰寬Wh/2，在一定的條件下，wh/2越窄，理論板數越高，相鄰峰的分離越好2。分離度

分離度用來表示相鄰兩峰分離的程度。分離度（R）的計算公式為：

2(tR2―tR1)

R=

W1+W2

八、液相色譜法42除另外有規定外，分離度應大于1.5。當分離度大于1.5時，相鄰兩峰達到了完全分離。

3.重復性取各品種