1.原生質體融合的方法及特點：無機鹽誘導融合；聚乙二醇、高pH高鈣誘導融合；電融合技術。（1）無機鹽誘導融合NaNO3作用：中和質膜的負電荷，使原生質體不再相互排斥，而緊密結合在一起不足：誘導頻率不高，約1%。1972年：Carlson誘導原生質體融合獲得首例雜種植株粉藍煙草和朗氏煙草體細胞雜種。（2）聚乙二醇：PEG橋梁,使原生質體凝聚——PEG被洗脫——導致質膜表面電荷重排，電荷的重排導致一個原生質體的負性電荷部位與另一原生質體的正性電荷部位相連而導致融合——膜接觸——融合優點：融合頻率高；可重復性強；毒性較低；誘發融合無特異性（植物+植物，植物+動物，動物+酵母）不足：PEG處理后線粒體變形；融合產物粘在融合器皿上；培養時融合體分裂頻率不高（3）高pH高鈣誘導融合：高鈣促進原生質體結合，高PH可以改變質膜表面的電荷性質，有利于融合。優點：雜種產量高，達到20-50%。不足：高pH值對細胞有毒害作用。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃時，誘發煙草葉肉原生質體融合。（4）電融合技術：原理：交流電場使原生質體表面電荷偶極化；原生質體沿著電極排列，形成串珠；施加直流電場后，形成串珠的原生質體在質膜接觸處發生穿孔，最后形成融合的原生質體。Senda1979年首先用此方法實現原生質體融合電融合儀的結構特點：一是交變電場部分；一是高頻直流電擊部分融合過程：原生質體接觸質膜融合——圓球化——核融合優點：無化學毒性，對細胞傷害?。蝗诤闲矢?；重復性強；融合技術操作簡便；電參數容易精確調節2.原生質體融合的方式，供體的處理，受體的處理。（1）對稱融合：是親本原生質體在融合前未進行任何處理（如輻射、碘乙酰胺等）的一種融合方式。優缺點但由于它綜合雙親的全部性狀，在導入有利性狀的同時，也不可避免地帶入了一些不利性狀（2）非對稱融合：在融合前，對一方原生質體進行射線照射處理，以鈍化其細胞核（供體，Donor），另一方原生質體（受體，Recipient）不處理或經化學試劑（如碘乙酰胺、碘乙酸、羅丹明6-G等）處理，所以也稱供-受體融合A、供體處理：造成染色體的斷裂和片段化，從而使供體染色體進入到受體后部分或全部丟失，達到轉移部分遺傳物質或只轉移細胞質的目的，處理方法：射線（X、γ和UV）輻射原生質體；限制性內切酶處理原生質體；紡錘體毒素、染色體濃縮劑處理原生質體B、受體處理：為了減少融合再生后代的篩選工作，利用一些代謝抑制劑（Metabolisminhibitor）處理受體原生質體以抑制其分裂常用的抑制劑：碘乙酸（Iodoaceticacid，IA）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IOA）和羅丹明6-G（Rhodamin6-G，R-6-G）【受IA、R-6-G和IOA處理的細胞和未受代謝抑制劑處理的細胞發生融合后，代謝上就會得到互補，從而能夠正常地生長】非對稱融合方式：“供體-受體”系統；“胞質體-原生質體”融合；“小原生質體-原生質體”融合3.雜種細胞的篩選與鑒定：互補選擇；機械分離雜種細胞法；雙熒光標記選擇法（1）互補選擇法：原理，利用2個親本對培養基、抗代謝物、或溫度等的敏感性存在著天然的互補性進行選擇叫互補法選擇。也可以利用隱性基因的互補性進行選擇。分類：A、激素自養型篩選；粉藍煙草和郎氏煙草的野生型葉肉細胞原生質體是激素異養型細胞，原生質體不分裂；雜種細胞是激素自養型細胞，且在沒有激素的培養基上可以旺盛分裂；使融合產物在不含激素的培養基上培養，能夠產生細胞團的就是融合的原生質體B、營養缺陷型突變互補；硝酸還原酶的蛋白突變體和輔因子突變體，突變體不能利用硝態氮，只能利用銨態氮。兩者的突變位點不同，原生質體融合后，硝酸還原酶恢復，可以利用硝態氮C、利用對抗代謝物質的敏感性互補進行篩選(2)機械分離雜種細胞法:原理，利用葉肉細胞和培養細胞原生質體的天然色澤標記進行選擇。方法：混合物培養3-5天后，在顯微鏡下用微吸管將融合產物（4-8個細胞的細胞團）轉移，進行微室培養。（3）雙熒光標記選擇法：異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色/異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色4.雜種植株的鑒定：（1）形態學鑒定；（2）細胞學鑒定；（3）分子標記鑒定；（4）熒光原位雜交技術；（5）蛋白質分析（1）形態學鑒定：雜種在形態上往往介于雙親之間，包括株型、葉形、花器官等（2）細胞學鑒定；染色體觀察：染色體數目是雙親之和，或少1至幾條染色體；細胞融合可以創造非整倍體、代換系、染色體片段置換系等材料流式細胞儀倍性分析：利用細胞倍性檢測儀可以粗略地分析雜種細胞的倍性，一般與雙親對照分析，測出的雜種的DNA含量基本是雙親之和。（3）分子標記鑒定：最有效的檢測手段