ICSFORMTEXT點擊此處添加ICS號FORMTEXT點擊此處添加中國標準文獻分類號FORMTEXTDB36DB36/FORMTEXT—FORMTEXTFORMTEXT黑斑側褶蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術規范TechnicalSpecificationforisolationandIdentificationofElizabethkingiamiricolainrananigromaculataFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施江西省市場監督管理局發布DBXX/XXXXX—XXXX前言 II1范圍 12規范性引用文件 13術語和定義 14設備和材料 15培養基和試劑 26分離與鑒定程序 37操作步驟 48菌種保存及生物安全 5附錄 6前言本文件按照GB/T1.1-2020給出的規則起草。本文件的某些內容有可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別這些專利的責任。本文件由江西省農業農村廳提出并歸口。本文件起草單位：江西省農業科學院畜牧獸醫研究所、南昌大學、江西省農業技術推廣中心。本文件主要起草人：劉文舒、王玉柱、郭小澤、李思明、簡少卿、李小勇、陳彥良、唐艷強、肖海紅。黑斑側褶黑斑蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術規范范圍本文件規定了黑斑側褶蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術規范。本文件適用于黑斑側褶蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T19489實驗室生物安全通用要求《動物病原微生物菌（毒）種保藏管理辦法》《中國微生物菌種保藏管理條例》術語與定義毀髓法pithing毀髓針刺入蛙枕骨大孔后，將針后端壓平,水平向前進入蛙顱腔,左右擺動，搗毀雙側腦組織腦脊髓。PCRPolymeraseChainReactionPCR是在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，是由于高溫變性、低溫退火等反應組成1個周期，循環進行，使目的DNA得以快速進行擴增。設備和材料除微生物實驗室常規滅菌與培養設備外，其他設備和材料如下：無菌采樣袋或商品化采樣棉拭子、剪刀一次性接種環無菌培養皿：90mm微量加樣器：1μL，2.5μL，10μL，100μL和1000μLTip頭（與微量加樣器相匹配）1.5ml無菌離心管有冷藏（4℃）和冷凍（－20℃）功能的冰箱恒溫培養箱手持式均質器：適用于1.5mL離心管電子天平：最小刻度0.01g顯微鏡（1000倍）高速冷凍離心機（≥12000r/min）恒溫水浴鍋PCR儀電泳儀自動凝膠成像系統渦旋儀微波爐無菌工作臺培養基和試劑除特殊說明，所有實驗用水應符合GB/T6682規定的三級水營養肉湯（附錄）非選擇性細菌培養基（附錄）DNAMarker：1Kb擴增片段長度及引物16SrDNA擴增片段長度：約1500bp上游引物序列：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′下游引物序列：1492r5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′gyrB擴增片段長度：約1200bp上游引物序列：gyrB3F5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′下游引物序列：gyrB14R5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′滅菌生理鹽水:0.6%10×PCR緩沖液Taq聚合酶（0.5U/μL）dNTPs（2mmol）1.2%瓊脂糖凝膠（附錄）50×TAE緩沖溶液（附錄）1×TAE緩沖溶液（電泳緩沖液）（附錄）核酸染料：GelRed分離與鑒定技術流程米爾伊麗莎白菌的確定形態學鑒定挑取疑似單菌落純化培養好的菌懸濁液搖晃均勻，在無菌狀態下劃線接種于無菌培養基中，恒溫培養箱（36℃±1℃）培養24h組織液與營養肉湯按照1:10比例進行混合，恒溫培養箱（36米爾伊麗莎白菌的確定形態學鑒定挑取疑似單菌落純化培養好的菌懸濁液搖晃均勻，在無菌狀態下劃線接種于無菌培養基中，恒溫培養箱（36℃±1℃）培養24h組織液與營養肉湯按照1:10比例進行混合，恒溫培養箱（36℃±1℃）培養24h剪碎或勻漿病變組織采樣毀髓法操作低溫麻醉病蛙的清潔和體表消毒分子生物學鑒分子生物學鑒定基因測序PCR基因測序PCR操作步驟采樣①病蛙采集回實驗室后，用清水清洗蛙體，置無菌操作臺紫外線滅菌待用；②將病蛙置于冰水混合物中低溫麻醉或對病蛙進行毀髓法操作；③待病蛙完全進入麻醉或死亡狀態后，取出病蛙，用吸水紙吸去體表水分；④用酒精棉球（75%消毒酒精）對病蛙體表和眼部消毒；⑤將殺菌消毒后的病蛙置于無菌操作臺內的托盤上，選取眼部病變明顯處，用鑷子和手術剪刀進行采樣。病菌的培養①在無菌狀態下將所采病變組織進行剪碎或勻漿；②將剪碎或勻漿后的組織液與營養肉湯按照1:10比例進行混合，恒溫培養箱（36℃±1℃）培養24h，觀察；③將培養好的菌懸濁液搖晃均勻，在無菌狀態下劃線接種于無菌非選擇性培養基中，恒溫培養箱（36℃±1℃）培養24h，觀察；④選取可疑菌落接種于新的無菌非選擇性培養基中，溫培養箱（36℃±1℃）培養24h，待進一步鑒定。病菌樣品的鑒定7.3.1形態學鑒定菌落顏色為米色或淡黃色，邊緣整齊，半透明，表面濕潤、光滑。7.3.2分子生物學鑒定7.3.2.1PCR模板的制備接種環挑選培養基上待檢菌的單獨菌落，置于0.5ml滅菌生理鹽水中，4000r/min離心2min，棄上清。再加0.5mL無菌水重懸并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰面上，冷卻后4000r/min離心30s，取上清液作為PCR模板待用。7.3.2.2PCR反應體系的配制根據PCR試劑用量，配制PCR反應體系。7.3.2.3PCR反應條件16SrRNA擴增條件：95℃預變性5min，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸90s，共32個循環，最后72℃延伸10min。gyrB擴增條件：95℃預變性5min，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環，最后72℃延伸10min。7.3.2.4電泳及成像觀察取5μLPCR擴增產物和1μL上樣緩沖液，混勻后加入1.2%瓊脂糖凝膠電泳加樣孔中，同時在空白孔加入Marker標準品。電泳結束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上，打開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進行成像觀察，確定PCR效果。7.3.2.5基因序列測序將擴增產物進行基因序列的測定，在NCBI對比，與已有基因同源性高于98%即可確定為米爾伊麗莎白菌。菌種保存及生物安全為了保護實驗室人員的安全，應由具備專業知識的人員進行檢測，所有培養物和廢棄物應參照GB/T19489及國家有關規定執行。菌種應由具備專業相關資質的實驗室根據《動物病原微生物菌（毒）種保藏管理辦法》《中國微生物菌種保藏管理條例》進行妥善保存。_________________________________

附錄1.營養肉湯（商品化試劑）成分：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化鈉10.0g/L；pH值7.2±0.2（25℃）。制作方法：將上述成分混合，加入雙蒸水或去離子水中，調整pH值至7.4±0.2，濾清，分裝，121℃滅菌15min。2.非選擇性細菌培養基成分：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化鈉10.0g/L；瓊脂15.0g/L；pH值7.2±0.2（25℃）。制作方法：將上述成分混合，加入雙蒸水或去離子水中，調整pH值至7.4±0.2，121℃滅菌15min，冷卻至50℃左右時在無菌狀態下傾注適量液態培養基至細菌培養平板中冷卻，備用。3.1.2%瓊脂糖凝膠稱取1.2g瓊脂糖，加入100mL0.5×TBE緩沖溶液中，加入核酸染料，微波爐加熱至完全融化，依據樣品數選用適宜的梳子，將瓊脂糖倒入凝膠盤中，膠板厚度