ICS65.020.30CCSB4512牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術CodeofpracticeforidentificationofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilkDB12/T1190—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由天津市農業農村委員會提出并歸口。本文件起草單位：天津市農業科學院。本文件主要起草人：馬毅、譚冬飛、陳麗麗、趙康、張漫、蘆娜、王麗學。IDB12/T1190—2023牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術規程本文件規定了的牛奶中A2型阝-酪蛋白（A2奶）的檢測原理、主要試劑配制、主要儀器設備、質譜檢測及數據處理參數、檢測方法、結果判定、廢棄物的處理和檢測過程中防止交叉污染的措施。本文件適用于牛奶和奶粉中A2型阝-酪蛋白（A2奶）的檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和實驗方法GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2阝-酪蛋白由209個氨基酸組成，其一級序列中的第67位氨基酸的種類為脯氨酸（Proline,P）時，3.2A2奶A2milk所含阝-酪蛋白為A2型的牛奶。3.3質荷比mass-to-chargeratio離子的質量m與其所帶的電荷數z之比，以m/z表示。4檢測原理阝-酪蛋白變體型對應的氨基酸突變位點為第67位組氨酸（Histidine,H）突變為脯氨酸（Proline,P），不同氨基酸之間存在分子量差異。利用質譜分析技術，根據差異肽段的分子量及質荷比差異將樣品蛋白質中存在氨基酸突變的肽段鑒定出來，從而確定氨基酸突變位點，實現對不同突變體型阝-酪蛋白檢測的目的。5試劑配制實驗所用水為符合GB/T6682規定的一級水；高壓滅菌條件為121℃,1.034*105Pa壓力，蒸汽滅菌20min。試劑配制如下：1DB12/T1190—2023——樣品裂解液：將480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L；——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：將10gSDS粉末溶于80mL蒸餾水中，加熱至68℃助溶，用HCl調pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過濾，高壓滅菌；——30%丙烯酰胺：將29g丙烯酰胺和1gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60mL的蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL；——1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：將181.65gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調pH至8.8，容至1000mL；——1mol/LTris-HCl（pH=6.8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調pH至6.8，容至1000mL；——10%過硫酸銨：將10g過硫酸銨粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL；——考馬斯亮藍染色液：量取甲醇45mL，蒸餾水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考馬斯亮藍R-250；——考染脫色液：50mL碳酸氫銨/乙腈=1：1；——1μg/μL胰蛋白酶：將100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mmol/L乙酸中，-70℃儲存；——25mmol/L碳酸氫銨：將2.0碳酸氫銨溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L。6儀器設備6.1單道可調移液器0.25～2.5μl、1～10μl、2～20μl、5～50μl、10～100μl、20～200μl、100～1000μl。6.210K超濾管超濾管截留蛋白分子量：30～90KDa。6.3離心機最高轉速12000r/min，最大容量24×1.5mL。6.4電子天平萬分之一精度。6.5凝膠成像分析系統有膠像素1280×1024，檢測靈敏度DNA≥0.05ng。6.6穩壓穩流電泳儀輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。6.7垂直電泳槽外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝膠板面積10cm×10cm。6.8高壓滅菌鍋使用溫度范圍45～135℃,最高使用壓力0.255Mpa。6.9自動雙重純水蒸餾器2DB12/T1190—2023功率3000W，出水量2500mL/h。6.10微波爐功率700W，容積20L。6.11冰箱6.12電熱恒溫水浴鍋RT+5～70℃7質譜檢測及數據處理參數應按照附錄A執行。8檢測方法8.1樣本采集每頭奶牛采集新鮮牛奶（排除頭奶和末乳）50mL，充分混勻后，-80℃保存。8.2蛋白提取8.2.1從-80℃取出牛奶樣本，常溫解凍后充分混勻，取樣50μL。8.2.2向上述樣品中加入500μL裂解液[8mol/L尿素，30mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）]。冰上裂解10min。4℃,20000g，離心30min。取上清，避免吸到油脂。8.2.3加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度10mmol/L。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至終濃度55mmol/L，暗室靜置1h。8.2.4使用考馬斯藍染色法（Bradford法）對蛋白質進行定量。8.2.5對定量后的蛋白質進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析（如附錄C.1）。8.3蛋白質的消化8.3.1取8.2.5中蛋白20μg，加入到10K超濾管中，14000g，4℃,離心40min，棄廢液。8.3.2加入200μL的25mmol/L碳酸氫銨（NH4HCO3），14000g，4℃,離心40min，棄廢液。8.3.3重復8.3.2步驟兩遍。8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。離心收集消化后的肽段。8.3.5真空抽干消化后的肽段。8.3.60.1%甲酸（FA）復溶肽段。8.4質譜鑒定8.4.1將8.3.5提取的酪蛋白肽段進行上機檢測。使用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜儀對獲得的酪蛋白肽段進行分離并檢測，液相及質譜檢測參數見表1～表3。3DB12/T1190—2023表1液相色譜柱參數表2液相色譜流動相洗脫梯度025表3質譜檢測-離子源參數數據依賴型采集(Independentdataacqui8.4.2對原始數據進行過濾、峰提取和篩選，確定特征性肽段。質譜掃描完畢，得到質譜原始文件，將質譜原始數據文件導入后，進行一級色譜峰的濾噪、峰提取、篩選出含有p.67位氨基酸的特征肽段，4篩選參數見表4。表4質譜峰篩選參數38.4.3篩選后的差異性肽段用Proteinpilot軟件進行差異肽段序列的比對和鑒定，檢索參數見表5。表5鑒定檢索參數Oxidation(M),Gln→Pyro-Glu(N-Glu→Lys(E),Met→Leu(M),Pro→His(P),Pro→Leu(P),His→Gl1/_Bosta9結果判定9.1SDS鑒定將從樣品中提取的蛋白質進行SDS分離鑒定，檢測蛋白條帶是否清晰無降解。條帶清晰，表示可用于后續檢測，否則重新取樣鑒定，檢測結果見圖1。5DB12/T1190—2023圖1SDS檢測結果（紅框內條帶為阝-酪蛋白）9.2A2型β-酪蛋白的判定根據質譜鑒定結果，當待測樣品的中p.67H氨基酸突變為p.67P（如圖2檢測結果表述為“A2圖2A2型阝-酪蛋白對應的氨基酸序列10廢棄物處理應按照GB/T19495.2的規定執行。11交叉污染防止措施應按照GB/T19495.2的規定執行。6DB12/T1190—2023（規范性）特征肽段質譜圖篩選并鑒定到的特征性肽段為LVYPFPGPIPN(59位到68位)，肽段中N端碎片離子為b離子模式，C端碎片離子為y離子模式，b2代表肽段中N端前兩個氨