Cellengineering00細(xì)胞工程

細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法，通過(guò)細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品的一門(mén)綜合性的生物工程。原理和方法操作水平目的分類(lèi)細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)細(xì)胞器、細(xì)胞或組織獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品動(dòng)物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程發(fā)展歷程哈伯蘭特提出了細(xì)胞全能性的理論，但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)嘗試沒(méi)有成功。斯圖爾德等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。科金用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。古哈等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時(shí)，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來(lái)的胚。卡爾森誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細(xì)胞種間雜種植株。土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進(jìn)了植物細(xì)胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合。1902年1958年1960年1964年1971年1974年植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是什么？什么是植物組織培養(yǎng)技術(shù)和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)？怎樣進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)？植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)CONTENTS目錄植物組織培養(yǎng)技術(shù)Planttissueculturetechnology01植物體細(xì)胞雜交技術(shù)Somatichybridizationofplants02習(xí)題鞏固Exercisestoconsolidate03

Fromsociety01從社會(huì)中來(lái)蘭花種子通常發(fā)育不全，在自然條件下萌發(fā)率極低；傳統(tǒng)分株繁殖的方式，又存在繁殖周期長(zhǎng)、繁殖率低等問(wèn)題，如果靠自然繁殖，蘭花的價(jià)格可想而知了。

如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖，從而走入尋常百姓家呢？利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以大量、快速地培育蘭花。植物組織培養(yǎng)技術(shù)PlanttissueculturetechnologyPART01離體

Planttissueculturetechnology01植物組織培養(yǎng)技術(shù)2.原理：1.概念：指

的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工控制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其分化為

的技術(shù)。離體完整植株植物細(xì)胞的全能性外植體外植體：在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，從植物體上被分離下來(lái)的，接種在培養(yǎng)基上供培養(yǎng)用的原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織、器官等。細(xì)胞經(jīng)過(guò)

后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能。分裂和分化

Planttissueculturetechnology——Totipotency01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——全能性1.具有全能性的原因：一般生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種的

。即都有發(fā)育成

所必需的全部遺傳信息。全套遺傳信息完整個(gè)體2.體現(xiàn)全能性的標(biāo)志：細(xì)胞→完整個(gè)體或其他各種細(xì)胞實(shí)例：胡蘿卜韌皮部細(xì)胞發(fā)育成完整植株受精卵發(fā)育成個(gè)體（動(dòng)植物）蜜蜂受精卵發(fā)育成工蜂，卵細(xì)胞發(fā)育成雄峰

用一片葉子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株

Planttissueculturetechnology——Totipotency01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——全能性實(shí)例：芽原基只能發(fā)育為芽，葉原基只能發(fā)育為葉3.生物體內(nèi)細(xì)胞不體現(xiàn)全能性的原因：基因在特定的時(shí)間和空間條件下

表達(dá)的結(jié)果。選擇性4.全能性大小比較：（1）分化程度低的

分化程度高的（2）細(xì)胞分裂能力強(qiáng)的

細(xì)胞分裂能力弱＞＞（3）受精卵

胚胎干細(xì)胞

生殖細(xì)胞

體細(xì)胞

植物細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞＞＞＞＞

Planttissueculturetechnology01植物組織培養(yǎng)技術(shù)3.一般過(guò)程：外植體愈傷組織試管苗完整植株脫分化芽、根等再分化生長(zhǎng)發(fā)育接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根移栽成活脫分化再分化再分化分化狀態(tài)未分化狀態(tài)

Planttissueculturetechnology——Dedifferentiation01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——脫分化外植體愈傷組織試管苗完整植株脫分化芽、根等再分化生長(zhǎng)發(fā)育1.脫分化：

在一定的

和

等條件的

下，

的細(xì)胞

，轉(zhuǎn)變成

的過(guò)程。激素營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)已經(jīng)分化失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能未分化的細(xì)胞①光照條件：②過(guò)程中涉及的生命活動(dòng)：一般不需要光照只有細(xì)胞增殖（有絲分裂），沒(méi)有細(xì)胞分化

Planttissueculturetechnology——Dedifferentiation01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——脫分化注意說(shuō)明1.外植體脫分化的難易因植物種類(lèi)、器官來(lái)源及生理狀況的

不同而不同。一般來(lái)說(shuō)，植物的花和幼嫩的組織脫分化相

對(duì)較易，而植物的莖、葉等成熟的組織脫分化則較難。2.該過(guò)程添加的外源激素主要是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素（比例適中），

因?yàn)槎吣軓?qiáng)烈地促進(jìn)愈傷組織的形成。③結(jié)果形成愈傷組織（不定形的薄壁組織團(tuán)塊）3.無(wú)菌操作——植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

Planttissueculturetechnology01植物組織培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織

細(xì)胞排列疏松且無(wú)規(guī)則、高度液泡化、呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞團(tuán)。3.再分化：

脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以

出芽或根等器官的過(guò)程。重新分化①實(shí)質(zhì)：②光照條件：基因的選擇性表達(dá)需要給予適當(dāng)強(qiáng)度的光照誘導(dǎo)葉綠素的合成，使試管苗能夠進(jìn)行光合作用原因：

Planttissueculturetechnology——Redifferentiation01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——再分化③過(guò)程中涉及的生命活動(dòng)：既有細(xì)胞增殖（有絲分裂），又有細(xì)胞分化。④結(jié)果：愈傷組織芽低高根生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素胚狀體4.胚狀體：

離體培養(yǎng)條件下，沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但是經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚狀類(lèi)似物，因而統(tǒng)稱(chēng)為體細(xì)胞胚或胚狀體。

Planttissueculturetechnology——Redifferentiation01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——再分化注意說(shuō)明影響植物組織再分化的因素a.外植體的遺傳特征和取材的位置會(huì)影響愈傷組織的再分化

能力。b.培養(yǎng)基的成分和物理性質(zhì)對(duì)器官的形成有一定的影響，但起決定作用的是植物激素，特別是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比。5.生長(zhǎng)發(fā)育：

將試管苗移到大田中栽培或進(jìn)行無(wú)土栽培，使之進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育為具有根、莖、葉且能開(kāi)花、結(jié)果的完整植株。

Planttissueculturetechnology01植物組織培養(yǎng)技術(shù)脫分化再分化過(guò)程外植體→愈傷組織愈傷組織→幼苗結(jié)果形成愈傷組織形成根、芽需要條件a.離體b.適宜的營(yíng)養(yǎng)c.生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例適中d.一般不需光a.離體b.適宜的營(yíng)養(yǎng)c.生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例高或低誘導(dǎo)生根或生芽d.光照決定植物脫分化、再分化的關(guān)鍵因素

Planttissueculturetechnology——TissuecultureofChrysanthemum01植物組織培養(yǎng)技術(shù)——菊花的組織培養(yǎng)1.原理：外植體愈傷組織試管苗完整植株脫分化芽、根等再分化生長(zhǎng)發(fā)育植物細(xì)胞一般具有

。全能性生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素

結(jié)果比值高(＞1)比值低(＜1)比值適中(=1)有利于根的分化，抑制芽的形成有利于芽的分化，抑制根的形成促進(jìn)愈傷組織的形成簡(jiǎn)記為：“高”根，“低”芽，“中”愈傷離體的莖尖、根尖、葉片、花藥等（外植體）

TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)2.目的：1）了解植物組織培養(yǎng)的基本原理2）了解生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的濃度、用量比例對(duì)菊花愈傷組織形成和

分化的影響3）嘗試進(jìn)行植物組織培養(yǎng)3.材料：離體的莖尖、根尖、葉片、花藥等（外植體）。4.MS培養(yǎng)基：水（去離子水）、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)（大量元素、微量元素）、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)（蔗糖、維生素、氨基酸）、天然附加物、植物激素（生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等）TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)5.步驟：制備外植體接種培養(yǎng)試管苗正常植株用酒精擦拭雙手和超凈工作臺(tái)臺(tái)面。將流水充分沖洗后的外植體。②消毒：③切割：無(wú)菌操作30S2-3次30min①材料：幼嫩的菊花莖段2-3次酒精無(wú)菌水次氯酸鈉溶液無(wú)菌水洗將消過(guò)毒的外植體置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌濾紙吸去表面的水分。用解剖刀將外植體切成0.5~1cm長(zhǎng)的小段。切割與接種TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)制備外植體接種培養(yǎng)試管苗正常植株在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3~1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上作好標(biāo)記。①接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基脫分化形成愈傷組織有光時(shí)，往往容易形成維管組織，而不易形成愈傷組織。將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養(yǎng)瓶置于18~22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長(zhǎng)情況。避光TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)制備外植體接種培養(yǎng)試管苗正常植株②接種到誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基③接種到誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)15~20d后，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上。長(zhǎng)出芽后，再將其轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上，進(jìn)一步誘導(dǎo)形成試管苗。接種室若先生根后面就不易生芽TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)制備外植體接種培養(yǎng)試管苗正常植株移栽前先打開(kāi)封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過(guò)毒的虹石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長(zhǎng)壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長(zhǎng)情況，適時(shí)澆水、施肥，直至開(kāi)花。TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)幼苗愈傷組織脫分化CTK/IAA比例適合再分化IAA/CTK比例先減小再增大植物組織培養(yǎng)過(guò)程示意圖完整植株外植體TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)6.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合某些微生物的生長(zhǎng)，如一些細(xì)菌、真菌等的生長(zhǎng)。培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。1.在植物組培過(guò)程中，為什么要進(jìn)行一系列的消毒，滅菌，并且

要求無(wú)菌操作？

胡蘿卜根形成層容易誘導(dǎo)成愈傷組織，其他部分如葉、花也能培養(yǎng)成小植株，只是稍微困難些。2.為什么切取胡蘿卜根的形成層，其他部分也能培養(yǎng)成小植株嗎？TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性好，適合栽培珍珠巖

,珍珠巖是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結(jié)構(gòu)，所以被命名為珍珠巖。蛭石是一種天然、無(wú)毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會(huì)膨脹的礦物。它是一種比較少見(jiàn)的礦物，屬于硅酸鹽。TissuecultureofChrysanthemum01菊花的組織培養(yǎng)外植體愈傷組織試管苗完整植株脫分化芽、根等再分化生長(zhǎng)發(fā)育黑暗光照離體無(wú)菌培養(yǎng)基適宜的外界條件(溫度、光照、氣體等)水瓊脂有機(jī)物無(wú)機(jī)物植物激素蔗糖：提供能量、調(diào)節(jié)滲透壓。植物激素：主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。Expand01拓展1）培養(yǎng)基名稱(chēng)：

；2）物理性質(zhì)：

；3）碳源：

。拓展1：植物組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基配方P116Expand01拓展拓展2：植物組織培養(yǎng)的兩種途徑胚狀體途徑器官發(fā)生途徑Expand01拓展拓展2：植物組織培養(yǎng)的兩種途徑胚狀體途徑器官發(fā)生途徑Furtherinquiry01進(jìn)一步探究

若想探究生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的使用比例對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響，則應(yīng)如何設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)？①

空白對(duì)照：不加任何激素；②

實(shí)驗(yàn)組1：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值為1；③

實(shí)驗(yàn)組2：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值大于1；④

實(shí)驗(yàn)組3：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值小于1。

能否從以上內(nèi)容中概括植物組織培養(yǎng)中細(xì)胞表現(xiàn)出全能性所需要的條件？

Planttissueculturetechnology01植物組織培養(yǎng)技術(shù)（1）離體狀態(tài)（2）無(wú)菌操作（3）種類(lèi)齊全、比例適合的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（4）植物激素（主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)（5）適宜的外界條件（溫度、pH、光照等）歸納——細(xì)胞表現(xiàn)全能性的條件植物體細(xì)胞雜交技術(shù)SomatichybridizationofplantsPART0202植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants要培育出如圖所示的番茄—馬鈴薯利用傳統(tǒng)有性雜交方法能實(shí)現(xiàn)嗎？為什么？不能，因?yàn)椴煌N生物之間存在著生殖隔離。

于是，這些科學(xué)家試圖用這兩種植物的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，來(lái)實(shí)現(xiàn)這一美妙的設(shè)想。02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants1.概念將不同來(lái)源的植物細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。融合實(shí)例:+=白菜甘藍(lán)白菜-甘藍(lán)02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants細(xì)胞融合初期人細(xì)胞鼠細(xì)胞人鼠雜交細(xì)胞細(xì)胞融合細(xì)胞融合37°培養(yǎng)40min參考動(dòng)物細(xì)胞融合，若是植物細(xì)胞之間的雜交，則應(yīng)先做什么？得到雜種細(xì)胞后，如何培育成植株？去除細(xì)胞壁（獲得原生質(zhì)體）原生質(zhì)體：是指去除細(xì)胞壁后的植物細(xì)胞原生質(zhì)層：是指植物細(xì)胞的液泡膜、細(xì)胞膜及其之間的細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成的紅色熒光素標(biāo)記的抗體綠色熒光素標(biāo)記的抗體02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

SomatichybridizationofplantsA細(xì)胞B細(xì)胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株移栽后的植株①①②③④⑤⑥①去除細(xì)胞壁纖維素酶去壁：酶解法果膠酶②誘導(dǎo)融合物理法：化學(xué)法電融合法、離心法聚乙二醇（PEG）融合法高Ca2+

-高pH融合法等③細(xì)胞壁再生④脫分化⑤再分化⑥移栽植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性2.過(guò)程02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants

體細(xì)胞融合成功后培養(yǎng)基中共有

種細(xì)胞類(lèi)型()，其中融合細(xì)胞類(lèi)型有3種()，而真正符合要求的是AB，因此要對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選。細(xì)胞融合后，共有幾種細(xì)胞類(lèi)型？融合細(xì)胞有幾種，符合要求的是哪種？AB5A、B、AA、BB、ABAA、BB、AB3.原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性（原生質(zhì)體融合）植物細(xì)胞具有全能性（雜種細(xì)胞培養(yǎng)成雜種植株）02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants（1）植物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志：再生出新的細(xì)胞壁（2）植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志：培育成新植物體4.標(biāo)志5.意義打破生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育植物新品種。在此過(guò)程中活躍的細(xì)胞器是

。線(xiàn)粒體和高爾基體6.研究現(xiàn)狀

仍有許多理論與技術(shù)問(wèn)題沒(méi)有解決，還不能讓雜種植株表現(xiàn)出人們所需要的所有性狀02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants+=白菜甘藍(lán)白菜-甘藍(lán)1.白菜（2N=18）與甘藍(lán)（2N=18）體細(xì)胞雜交所得植株白菜-甘藍(lán)的細(xì)胞染色體數(shù)為

，屬于

倍體。36

（異源）四

2.白菜（2N=18）與甘藍(lán)（2N=18）進(jìn)行雜交（相互授粉），

所得植株白菜-甘藍(lán)的細(xì)胞染色體數(shù)為

，屬于

倍體。（異源）二

18

基因重組染色體數(shù)目變異02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants7.變異類(lèi)型染色體數(shù)目變異

生殖類(lèi)型變異類(lèi)型染色體數(shù)染色體組數(shù)基因組成無(wú)性繁殖，育種過(guò)程中不遵循孟德?tīng)柖扇旧w數(shù)目變異兩親本染色體數(shù)之和。2n+2m兩親本染色體組數(shù)之和。2+2兩親本基因型之和。AaBbCcDd02植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

Somatichybridizationofplants植物體細(xì)胞雜交育種四倍體雜交育種誘導(dǎo)多倍體四倍體二倍體如何處理植株使其可育？看減數(shù)分裂聯(lián)