ICS:11.120.99C10/29團體標T/CACM0122016金錢白花蛇快速PCR鑒定QulicklypcRidentificationofBulngarulsparvuls2016-12-12發布2016-12-12實施中華中醫藥學會發布前言 2規范性引用文件 3術語和定義 5儀器設備 6試劑和溶液配制 7檢驗程序 8結果判定 9結果報告 附錄A(資料性附錄)金錢白花蛇快速PCR鑒定體系的建立 本標準的全部技術內容為推薦性。本標準是對《中華人民共和國藥典》標準的補充。本標準由中華中醫藥學會歸口。本標準起草單位:中國中醫科學院中藥資源中心、廣東省食品藥品檢驗所。本標準主要起草人:袁媛、黃璐琦、李華、蔣超、楊志業、趙玉洋、何雅莉。請注意本標準的某些內容有可能涉及專利,本標準的發布機構不應承擔識別這些專利的責任。1金錢白花蛇快速PCR鑒定本標準規定了使用快速PCR鑒定金錢白花蛇藥材和飲片的通用方法和要求。本標準適用于金錢白花蛇藥材和飲片鑒定。2規范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。《中華人民共和國藥典》(2015年版)GB/T6682《分析實驗室用水規格和試驗方法》GB/T23632《進境植物檢疫截獲有害生物鑒定復核規程》GB/T27403《實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測》3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。按一定規則取自某一整體的一個或多個部分,并能反映該整體的相關信息,可以作為判斷該整體的基礎。從樣品提取出DNA的方法。通過一定技術使一段特定的DNA片段拷貝數增加的過程,可通過聚合酶鏈式反應技術實現。聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction(PCR)模板DNA先經高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應的一段互補序列發生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環,使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數呈幾何倍數擴增。其擴增產物可通過多種特異性和敏感性好的方法進行分析。一般使用對照藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產物檢測過程,用于證明鑒定過程可獲得目標核酸片段的操作。使用常見偽品藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產物檢測過程。以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產物檢測過程,用以證明提取過程中沒有核酸2污染。金錢白花蛇快速PCR鑒定應采用抽取有代表性的送檢樣品與對照藥材比較的驗證方式,即依據金錢白花蛇特異性DNA序列進行鑒定。利用堿裂解法提取金錢白花蛇模板DNA,以提取的DNA為模板進行PCR擴增,熒光檢測或瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。5儀器設備所有制備樣品使用的器具在使用前應滅菌處理。使用前應進行溫度校準。5.1.2手持式紫外燈5.1.3連續可調微量移液槍5.1.4保溫設備6試劑和溶液配制除另有規定外,實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑;實驗用水符合GB/T6682的要求;所配制的試劑均應滅菌后保存,并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期和配制者姓名;PCR試劑應小量分裝保存以減少污染;材料及試劑的保存都應有防污染措施。含有0.5mol/L氫氧化鈉(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)、1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)溶液:在800mL去離子水中溶解26.2中和緩沖液含有0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)溶液,pH值為8.0:在800mL去離子水中溶解12.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris),冷卻至室溫后用濃鹽酸調節溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。6.3dNTP混合液6.520%PVP溶液在80mL去離子水中溶解20.0gPVP-40,加水定容至100mL,分裝后過濾除菌,冷卻后-20益保存。在80mL去離子水中溶解1.0g牛血清白蛋白(BSA),加水定容至100mL,分裝后過濾除菌,冷卻后-20益保存。時置冰上操作。36.8金錢白花蛇檢測用引物對序列2EDTA·2H2O,加入醋酸,充分混勻,加去離子水定容至1L,室溫保存,使用時用去離子水50倍稀釋。在80mL去離子水中溶解溴酚藍250mg,二甲苯青250mg,蔗糖250mg,加水定容至100mL,分裝。7檢驗程序為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增和產物檢測應在不同操作間或在同一操作間不同隔離區域進行,進入各區域應嚴格按照單一方向進行,即樣品制備區寅核酸制備區寅擴增區寅檢測區。送檢樣品抽樣方法參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部藥材和飲片取樣法(通則0211)進行取樣。送檢樣品應可分成2批,每批可分為同樣的3份,總量不應少于20g。收樣時應檢查包裝的完整性,并在樣品袋上貼上標簽,填寫采集數據表。對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄,照片隨樣品一起備檔。去除藥材和飲片表面附著物,依次使用75%乙醇和無菌雙蒸水擦拭表面后晾干。取送檢樣品置乳缽、勻漿機或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎,必要時加適量液氮研磨。800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min或靜置5min;轉移500滋L上清液至一新的EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1),作)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(5mL離),為DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(心管),模板)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(加入5),待測或)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(滋),0)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(L),益)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(中),保)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(和),存)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(緩),備)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(沖),用)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(充),個)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(分),送)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(混),檢)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(勻),樣)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1),品)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2000r/),必須重)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(離心),次)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1m),每)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(n或靜置5m),1次從送檢樣)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(轉),提)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(移),取)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(上),核)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(清),酸)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(液),的)過程都必須設置1個提取空白對照。注:使用堿裂解法提取的金錢白花蛇DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜長期保存。7.4核酸擴增首次使用本方法時,應校對PCR儀溫控準確性,并使用陽性對照和陰性對照以核對使用的Taq聚合酶的適用性。7.4.1對照試驗PCR檢測應重復2次,并設置陽性對照、陰性對照和空白對照。7.4.2PCR反應體系EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(在),液)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(0滋L),10m)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(PC),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(管中),1滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(反應),引物)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(體),0滋)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(L),各)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(應),滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(系),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(包括10伊PCR),qDNA聚合酶)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(緩),1滋)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(沖),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2),模)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(5滋L),板D)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(T),1)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(P),0)7.4.3PCR反應參數延伸10s,30個循環。對擴增產物進行檢測或置4益下保存。47.5擴增產物檢測7.5.1熒光染料顯色檢測長下檢測熒光,若PCR產物出現與陽性對照相同的熒光即為陽性結果,反之為陰性結果。7.5.2瓊脂糖凝膠電泳檢測取PCR擴增產物,加入6伊上樣緩沖液混勻,2%瓊脂糖凝膠電泳染色,紫外波長下檢測。陰性對照和空白對照無條帶,且送檢樣品與陽性對照在500~750bp范圍內有一條DNA條帶為陽性結果,否則為陰性結果。8結果判定在陰性對照、陽性對照和空白對照結果符合規定的情況下,若送檢樣品與陽性對照一致,則判定測試結果為陽性,否則為陰性。9結果報告9.2鑒定報告樣品經檢測后,實驗室應根據實驗的具體操作程序和結果做好詳細的實驗記錄,出具檢測報告。檢測報告至少包含以下內容:送檢樣品的名稱、狀態和明確的標識;檢測依據;取樣方法與日期;儲存條件;檢測開始和結束日期;檢測負責人和實驗人員;陽性對照、陰性對照、送檢樣品;特定方法取得的結果,結果使用的單位及計算方法;檢測結論;檢測過程觀察到的特別情況;其他需要報告的內容。檢測結果應來自同一實驗室樣品的兩份送檢樣品。當一份送檢樣品的結果為陽性,另一份為陰性時,要重新測試。可以適當增加核酸擴增反應體系中DNA模板量,使兩份樣品得到相同結果。每個樣品應至少制備兩份DNA,必要時需檢測模板DNA的質量,確保提取的DNA片段大于擴增片段。核酸擴增可設置PCR抑制劑對照。如果經過兩次以上從核酸提取開始的重復檢測,檢測結果不一致,可在檢測報告中注明檢測低限,檢測低限應符合最低含量水平。11廢棄物處理檢測過程中的廢棄物,收集后在焚燒爐中焚燒處理,有毒有害廢棄物應經過除害再進行處理,處理要符合環保要求。5附錄A(資料性附錄)金錢白花蛇快速PCR鑒定體系的建立A.1金錢白花蛇及其偽品資料金錢白花蛇為2015年版《中國藥典》的收錄品種,來源于眼鏡蛇科環蛇屬動物銀環蛇BungarusmulticinctusBlyth的幼蛇干燥體。目前藥材市場上金錢白花蛇偽品數目很多,質量問題嚴重,其偽品共分為3大類:淤形態類似的其他種屬幼蛇,包括赤鏈蛇、赤鏈華游蛇、中國水蛇、鉛色水蛇、金環蛇、黃鏈蛇、黑背白環蛇等;于拼接蛇,系指使用金錢白花蛇頭,拼接其他偽品蛇的蛇身制成成品,主要有鉛色水蛇畫上橫紋拼接金錢白花蛇身,或赤鏈蛇、赤鏈華游蛇染色后接上金錢白花蛇頭制成的偽品;盂把大條的銀環蛇切開,加工成小蛇形態,接上金錢白花蛇頭制成的偽品。對亳州、安國、玉林、廣州、昆明等幾個大型藥材市場進行走訪調查發現,在市場上見到的金錢白花蛇偽品總共有6種,分別為鉛色水蛇、中國水蛇、赤鏈蛇、赤鏈華游蛇、金環蛇、眼鏡蛇,其中最為常見的是赤鏈蛇和赤鏈華游蛇。A.2引物設計使用BioEdit軟件對正品金錢白花蛇以及黑眉錦蛇、紅點錦蛇、滑鼠蛇、赤鏈華游蛇、赤鏈蛇等偽品的Cytb序列進行序列比較圖A.1金錢白花蛇正偽品序列比對及引物設計結果6A.3實驗樣品采集不同藥材市場與13家不同藥房金錢白花蛇樣品進行方法的適用性檢測;采集各大藥材市場中存在的24種其他科屬蛇類樣品進行特異性檢測,見表A.1。表A.1蛇類樣品表物種拉丁名采集地個數1烏梢蛇安徽亳州82烏梢蛇北京同仁堂13烏梢蛇中藥資源中心14烏梢蛇北京永安堂15金錢白花蛇安徽亳州6金錢白花蛇深圳市藥品檢驗所27金錢白花蛇河北安國17金錢白花蛇各大藥房7蘄蛇安徽亳州48蘄蛇安徽黃山19蘄蛇北京同仁堂1蘄蛇北京永安堂1蘄蛇中藥資源中心1眼鏡蛇安徽亳州3孟加拉眼鏡蛇安徽亳州1中國水蛇安徽亳州2鉛色水蛇安徽亳州1鉛色水蛇河北安國1赤鏈蛇安徽亳州3竹葉青安徽亳州1王錦蛇安徽亳州3王錦蛇深圳市藥品檢驗所1王錦蛇中國食品藥品檢定研究院1紅紋滯卵蛇安徽亳州1紅紋滯卵蛇中國食品藥品檢定研究院1灰鼠蛇安徽亳州2短尾蝮蛇安徽亳州1蝮蛇安徽亳州1黑眉錦蛇深圳市藥品檢驗所1黑眉錦蛇江西昌北1平頦海蛇安徽亳州2三索錦蛇河北安國1百花錦蛇中國食品藥品檢定研究院1赤鏈華游蛇中國食品藥品檢定研究院1虎斑游蛇中國食品藥品檢定研究院1虎斑游蛇河北安國1山烙鐵頭蛇中國食品藥品檢定研究院17A.4PCR反應體系的建立模板/對照DNA(10~50ng)1滋L,用無菌雙蒸水補足反應體積至25滋L。將反應液振蕩心。將PCR管置PCR儀內進行PCR反應。PCR反應程序:94益預變性1min;94益變性10s,62益退火延伸10s,30個循環,獲得擴增產物。取出PCR管,對反應產物進行檢測或置4益下保存。取5滋L反應液經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,染色后接通電源按5V/cm恒壓進行電泳20min,電泳結束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數均經過系統的考察。A.4.1堿裂解法提取蛇類材料總DNA使用堿裂解法提取蛇類樣品總DNA,使用通用引物Cytb-H/Cytb-L進行擴增,以檢測所獲得蛇類樣品總DNA是否適用于PCR擴增。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明,利用Cytb-H/Cytb-L引物,所有樣品均獲得約400bp大小的擴增產物,見圖A.2,說明堿裂解法提取的DNA可以滿足PCR反應的要求。M1M1234567891011121314151617181920212223C圖A.2Cytb-H/Cytb-L通用引物擴增結果M:DL2000marker;1:烏梢蛇;2:金錢白花蛇;3:蘄蛇;4:眼鏡蛇;5:孟加拉眼鏡蛇;6:中國水蛇;7:鉛色水蛇;8:鉛色水蛇;9:赤鏈蛇;10:竹葉青;11:王錦蛇;12:王錦蛇;13:王錦蛇;14:紅紋滯卵蛇;15:灰鼠蛇;16:蝮蛇;17:黑眉錦蛇;18:平頦海蛇;19:三索錦蛇;20:百花錦蛇;21:赤鏈華游蛇;22:虎斑游蛇;23:山烙鐵頭蛇;C:陰性對照A.4.2金錢白花蛇分子鑒定條件考察使用設計的金錢白花蛇快速PCR鑒定引物對不同產地金錢白花蛇及其混偽品進行擴增,并考察:淤退火溫度:58益,60益,62益,64益;于PCR循環數:30,28,26,24,22個循環;盂變性溫度:司),TC-512型PCR擴增儀(TECHNE公司)。對金錢白花蛇鑒定結果進行考察,結果表明,PCR反應程序中,94益預變性1min后,滿足變性溫度超過88益,變性時間超過5s,退火溫度在58~64益之間,退火時間超過5s,循環數超過28個循環參數均可準確鑒定金錢白花蛇,見圖A.3。為增加金錢白花蛇鑒定的穩定性,標準制定參數均在此基礎上有所提高。最終確定金錢白花蛇快速PCR鑒定的反應程序為:94益預變性1min;A.4.3方法的適用性與特異性考察采用上述確定的程序,對金錢白花蛇13批樣品及20批偽品進行鑒定(圖A.4、圖A.5),結果表明該體系能穩定準確地鑒定金錢白花蛇。8退火溫度退火溫度變性溫度58℃60℃62℃64℃M12121212變性時間20SM1212121212循環次數PCR儀Tsq酶30C28C26C24CM121212121212121212121292℃90℃88℃86℃abCdABC退火時間20S10S10S5S5S3S3Slsls圖A.3金錢白花蛇快速PCR反應的優化1:金錢白花蛇;2:眼鏡蛇。A:VeritiPCR擴增儀(AppliedBiosystems公司);B:9700型PCR擴增儀(ABI公司);C:TC-512型PCR擴增儀(TECHNE公司)。a:rTaq(Takara公司)MM12345678910111213141516圖A.