二輪必備精品2025年高考生物

復習講練測第1講

基因工程專題八

生物技術與工程二輪一、重組DNA技術的基本工具1.限制酶：（1）來源及原因?（2）作用?（3）限制酶切割目的基因時需切割幾次?產生幾個末端?斷開幾個磷酸二酯鍵?2.DNA連接酶：（1）作用?（2）分類?來源?作用的差別?3.載體：（1）載體的種類?（2）載體的作用?（3）質粒是什么?（4）作為載體必須具備的條件是什么？希望我們二輪復習能夠持續精進！——自主梳理課本（選必三）3.11.基因工程(1)概念理解必備知識基因重組分子受體目的基因遺傳性狀(2)理論基礎必備知識拼接的基礎1.DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）表達的基礎2.都遵循堿基互補配對原則3.DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構1.基因是控制生物性狀的結構與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循中心法則基因在空間上轉移并成功表達3.生物界共用一套遺傳密碼。（相同的遺傳信息在不同的生物體內表達出相同的蛋白質）。DNA（基因）

轉錄翻譯mRNA蛋白質磷酸二酯黏性基本工具基本工具AGTCATTCGATAGGATCATCATAT限制酶CCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGG限制酶黏性末端平末端知能必備【教材拾遺】(1)[選擇性必修3P71旁欄]原核生物中限制酶的作用是

。(2)[選擇性必修3P74拓展應用T1]限制酶來源于原核生物,不切割自己的DNA分子的原因是

。必備知識切割外源DNA以保證自身安全,防止外來病原物的危害原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾高考調頻考點——限制酶選取原則

①不破壞目的基因原則②保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點③確保出現相同黏性末端原則，切割質粒的限制酶要與切割目的基因的限制酶相同④若質粒上標出T-DNA片段,則所選限制酶切割位點應位于T-DNA片段中設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ,則下圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取,而丙Ti質粒宜選取。高考調頻考點——限制酶選取原則

1.回答下列問題:已知在新霉素抗性基因內部存在HindⅢ識別序列，質粒的其他部位和目的基因內部均無XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ三種限制酶的識別位點，假設tPA基因為680bp，若只選擇SacⅠ對目的基因和質粒進行酶切，缺點是__________________________________________________；若選擇XbaⅠ、SacⅠ對目的基因和質粒進行酶切，缺點是___________________________；因此最好選用____________________對目的基因和質粒進行酶切。不能避免目的基因的自身環化和反向連接無法篩選空質粒和重組質粒XbaⅠ、HindⅢ①防止目的基因和載體自身環化方法總結：雙酶切的優點②防止目的基因與載體反向連接高考調頻考點——限制酶選取原則單酶切知識點二、基因表達載體的構建基因工程的核心3.構建過程：將同一種限制酶切割獲得的目的基因和質粒混合后加DNA連接酶會出現的連接方式有:質粒目的基因自身環化目的基因自身環化質粒自身環化質粒與目的基因反向連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接自身連接問題4:怎么改進解決以上問題？高考調頻考點——限制酶限制酶HindⅡAluⅠBamHⅠSau3AⅠ識別序列及切割位點↓5'-GTYRAC-3'

↓5'-AGCT-3'

↓5'-GGATCC-3'

↓5'-GATC-3'【典例1】下表是幾種限制酶的識別序列及切割位點（Y=C或T，R=A或G）。下列相關敘述正確的是（）A．限制酶切割一次需切斷2個磷酸二酯鍵，增加2個游離的磷酸基團B．一種限制酶只能識別一種核苷酸序列，并在特定位點切割C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E.coliDNA連接酶連接D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段進行重組后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能識別并切割A一種限制酶不一定只識別一種核苷酸序列，如HindⅡ用AluⅠ切割得到的是平末端,E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端Sau3AⅠ可識別并切割重組片段[2023湖北卷-T22]構建重組質粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是

。高考調頻考點——DNA連接酶④考點一

基因工程的基本工具歸納提升與DNA有關的幾種酶的比較8.某同學擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點）和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是（

）A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C高考調頻考點——限制酶11題圖作業

生物二輪復習大本125頁

真題引領3127頁1、3題128頁10題第二張卷子（真題引領3）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如上圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環素）培養基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養基中能形成菌落D高考調頻考點——限制酶第一步：目的基因的篩選與獲取，目的基因的獲取方法?第二步：基因表達載體的構建1.基因表達載體的構建目的?2.5個組成？標記基因的作用？復制原點的作用？啟動子：本質？位置作用？什么是誘導型啟動子？終止子：本質？位置？作用？3.構建過程？(3條)雙酶切（兩種不同的限制酶）分別切割目的基因和質粒，優勢？第三步：將目的基因導入受體細胞1.轉化的概念？導入的方法、受體細胞？2.農桿菌轉化法過程？(注意兩次拼接、兩次導入)、原理？第四步：目的基因的檢測與鑒定1.檢測與鑒定目的？分子水平檢測什么？檢測方法有？2.個體生物學水平的鑒定方法？二、基因工程的基本操作程序(2)構建目的基因表達載體。科研人員從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構建表達載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉錄方向）。圖中①為

；②為

，其作用是

；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標記基因，其作用是

。高考調頻考點——基因表達載體的構建終止子啟動子RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。(3)目的基因的表達。科研人員將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達，發現大腸桿菌有的發綠色熒光，有的發黃色熒光，有的不發熒光。請從密碼子特點的角度分析，發綠色熒光的可能原因是

（答出1點即可）。密碼子具有簡并性項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA使轉錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”。細胞類型植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法____________法、____________法________技術受體細胞受精卵、體細胞________原核細胞使用最廣泛的是大腸桿菌農桿菌轉化花粉管通道顯微注射受精卵辨析農桿菌轉化法中的“兩個兩次”①兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA的中間部位；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞染色體的DNA上。②兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；第二次導入是指將含目的基因的T-DNA導入受體細胞。03將目的基因導入受體細胞Ca2＋處理法轉化：指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程。04目的基因的檢測與鑒定雙標記篩選方法：①將轉化后的細菌放在含氨芐青霉素培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌、含質粒的細菌和含質粒—質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落；②再利用滅菌的絨布影印到含四環素培養基上，不生長的即為含目的基因的菌落，如圖1、5。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。篩選含目的基因的受體細胞（以大腸桿菌為例）——標記基因的作用八省聯考關鍵能力提升：據圖分析抗蟲棉的培育過程。(1)該過程中的目的基因是

，載體是

。(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？Bt基因Ti質粒為了避免目的基因和載體的自身環化和反向連接。(3)為了保證目的基因在受體細胞中能正確表達，對目的基因在質粒中的插入位點有什么要求？目的基因應插入啟動子與終止子之間。(4)該實例中，導入目的基因的方法是

。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？由于Ti質粒上的T－DNA可轉移到受體細胞且能整合到受體細胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，農桿菌轉化法(5)將目的基因導入受體細胞時，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細胞分裂可能導致目的基因丟失，無法穩定遺傳。(6)該實例中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪些？

抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲。考點二

基因工程的基本操作程序三、實驗：DNA的粗提取與鑒定1.DNA粗提取與鑒定的原理？2.不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞的原因？3.研磨后過濾的方案是？4.4℃冰箱放置幾分鐘的作用？攪拌時應輕緩、并沿一個方向的原因？

5.鑒定試劑？四、PCR及電泳鑒定1.DNA體外擴增的原理？DNA片段電泳鑒定原理？2.DNA片段擴增的具體過程。3.PCR：名稱、原理、儀器、條件、過程?緩沖溶液中添加Mg2+的作用?用PCR可以擴增mRNA嗎？引物的作用？DNA復制的方向?引物是什么？引物的種類？為何需要2種引物？擴增n次需要多少個引物：至少需經過幾次循環才能分離得到所需要的DNA區段？鑒定PCR產物的方法？希望我們二輪復習能夠持續精進！——自主梳理課本（選必三）3.18．（2024·湖南）現發現某植物群體中有一植株，推測其Rubisco的編碼基因發生突變所致。Rubisco由兩個基因（包括1個核基因和1個葉綠體基因）編碼，這兩個基因及兩端的DNA序列已知。擬以該突變體的葉片組織為實驗材料，以測序的方式確定突變位點。寫出關鍵實驗步驟：①_____________；②______________

；③________________；④基因測序；⑤_________________

。序列比對分析提取DNA設計引物進行PCR反應高考調頻考點——引物Q1：引物是什么？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。長度約為20~30個核苷酸。細胞中：一段單鏈RNA，PCR中：一段人工合成的單鏈DNA。Q2：為什么需要引物？DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。Q3：引物的作用？使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。Q4:設計引物的依據是？目的基因兩端的核苷酸序列。高考調頻考點——引物Q5:為什么延伸時需要加入兩種引物？

DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增。Q6:兩種引物與模板鏈的哪一端配對？引物的5′端與模板鏈的3′端互補配對3’5’3’5’Q7:引物設計的要求（或引物失效的原因）？a.引物自身不能環化。b.兩種引物之間不能發生堿基互補配對。高考調頻考點——引物Q8:引物的3‘端和5‘端哪個能改造？引物的3‘端為結合模板DNA的關鍵堿基,一般不能改造，5'端無嚴格限制,可用于添加限制酶切割位點等序列。可在引物的5’端加上限制酶的識別序列。Q9:為了便于將擴增的DNA片段與運載體連接，可如何操作？使目的基因定向（正確）插入載體并避免目的基因自身環化。Q10:在兩種引物上設計加入不同的限制酶識別序列,主要目的是？(3)在利用PCR技術擴增R（抗旱）或r基因過程中，利用__________可尋找抗旱基因的位置并進行擴增。(4)設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的2組引物（圖5）都不合理，請分別說明理由。①第1組：________________________________________;②第2組：________________________________________。(4)科研過程中，可用PCR技術檢測受體細胞是否成功轉入了目的基因。提取轉染后的細胞的全部DNA分子，用目的基因的引物擴增。擴增完畢后，檢測發現擴增產物中除目的基因外，還有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有：________。①模板受到污染；②退火溫度過高；③引物太短；④延伸溫度偏低。高考調頻考點——引物①③引物引物I和引物II局部發生堿基互補配對引物I自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效[方法總結]1.設計引物的主要原則①引物長度通常為20~30個核苷酸,可防止隨機結合。②兩種引物之間不能互補配對③引物自身不能環化④為構建合適酶切位點,常常需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識別序列。引物太短，錯配幾率大，特異性弱PCR基礎知識回顧全稱：原理：反應條件：聚合酶鏈式反應DNA半保留復制①緩沖溶液（含Mg2+）；②DNA模板；③2種引物（引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸）；④4種脫氧核苷酸；⑤耐高溫的DNA聚合酶；PCR基礎知識回顧擴增過程：變性：雙鏈DNA解聚為單鏈；復性：兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合；延伸：4中脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。PCR基礎知識回顧產物鑒定：PCR異常情況分析；擴增不成功：擴增結果不止一條條帶：瓊脂糖凝膠電泳；漏加了PCR的反應成分；各反應成分的用量不當；PCR程序設置不當等；引物設計不合理，與非目的序列有同源性，擴增產生非目的序列；引物容易形成二聚體，形成短小條帶；復性（退火）溫度過低，引物與非目的序列結合；DNA聚合酶的質量不好，在延伸過程中從模板脫落，產生不完整的短片段。(1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產生乙肝病毒，原因是

。(2)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導入酵母細胞中表達。重組表達載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是

。能識別載體中的啟動子并驅動目的基因轉錄的酶是。

1．（2023·全國·統考高考真題）接種疫苗是預防傳染病的一項重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）。回答下列問題。高考調頻考點——綜合考查

重組乙肝疫苗成分為蛋白質，無法獨立在宿主體內增殖。

鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。RNA聚合酶高考調頻考點——綜合考查(3)目的基因導入酵母細胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細胞中提取

進行DNA分子雜交，DNA分子雜交時應使用的探針是

。(4)若要通過實驗檢測目的基因在酵母細胞中是否表達出目的蛋白，請簡要寫出實驗思路。核染色體DNA被標記的目的基因的單鏈DNA片段實驗設計思路：通過使用相應抗體，利用抗原-抗體雜交技術，檢測mRNA是否翻譯形成蛋白質。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復制原點；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。10題圖6．（2024·福建·高考真題節選）(1)利用PCR技術獲取目的基因hCD46，復性溫度下發生的擴增過程是________________________________________________。(4)利用PCR技術對子代小鼠進行hCD46基因檢測，應設置不加DNA模板的對照組，目的是_____________________________________________________。7．（2024·安徽·高考真題節選）(1)擴增X基因時，PCR反應中需要使用TaqDNA聚合酶，原因是_____________________

__________________________________________________________________________________。兩種引物分別與含hCD46基因的兩條模板鏈結合排除PCR體系中外源DNA的污染在PCR反應中，需要利用高溫使DNA雙鏈解旋，普通的DNA聚合酶在高溫下會變性失活，而TaqDNA聚合酶能夠耐高溫,在高溫條件下依然具有活性。9．(2024·新課標真題節選)設計實驗驗證某血液樣品中有HIV，簡要寫出實驗思路和預期結果。思路:從樣品中提取RNA,逆轉錄得DNA,用HIV核酸特異性引物進行PCR,電泳檢測PCR產物。結果: