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ICS11.220DB37/T2842—2016鴨坦布蘇病毒抗體間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法2016-09-18發布2016-10-18實施IDB37/T2842—2016本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由山東省畜牧獸醫局提出。本標準由山東省畜牧業專業標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：山東農業大學。本標準主要起草人：刁有祥、唐熠、陳浩、馮強、提金鳳、高緒慧。1DB37/T2842—2016鴨坦布蘇病毒抗體間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法本標準規定了鴨坦布蘇病毒抗體間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法所需試劑及儀器、檢測本標準所規定的鴨坦布蘇病毒抗體間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法，適用于檢測鴨血清2試劑及儀器2.1試劑2.1.3坦布蘇病毒抗原：原核表達的重組坦布蘇病毒E蛋白。2.1.4酶標二抗：羊抗鴨辣根過氧化物酶標記的IgG。2.1.5磷酸鹽緩沖液(PBS),見A.1。2.1.6包被液，見A.2。2.1.7洗滌液，見A.3。2.1.8樣品稀釋液(封閉液),見A.4。2.1.10終止液，見A.5。2.2.2微量加樣器。2.2.3聚苯乙烯板。2.2.4水平振蕩器。2.2.5恒溫培養箱。3.2被檢血清樣品用樣品稀釋液按1:40倍稀釋。4操作步驟4.1試驗試劑預溫到20℃~25℃。2DB37/T2842—20164.2將抗原按照濃度為2.6ng/μL用碳酸鹽緩沖液稀釋，每孔100μL加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育過夜后，用洗滌液100μL洗板3次，每次置于水平振蕩器300r/min震蕩3min,甩干板上殘余4.3每孔加入200μL封閉液，37℃溫箱孵育1h,用4.2方法洗板。4.5將待檢血清樣品加入其他各孔，每孔100μL,37℃溫箱孵育1h,用4.2方法洗板。4.6酶標二抗用樣品稀釋液按1:500倍稀釋，每孔加100μL,37℃孵育1h,用4.2方法洗板。4.7每孔加100μL底物溶液，37℃避光孵育15min。4.9置酶標儀于450nm測定各孔樣品吸光度(OD)值，該操作需30min內完成。值)/2;陽性對照OD均值等于(A3孔OD值+A4孔OD值)/2。5.2陽性對照平均值減去陰性對照平均值，其差必須大于0.40;陰性對照平均值必須小于等于0.20。5.3.1陽性樣品OD450≥0.40,待檢血清為陽性；即已感染坦布蘇病毒。5.3.2陰性樣品OD450≤0.20,待檢血清為陰性；即未感染坦布蘇病毒。5.3.3可疑樣品0.20<0D450<0.40,判為可疑，重新測定。3(規范性附錄)試劑配制A.1磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/LpH7.4)NaClKClKH?PO?Na?HPO?·12H?O蒸餾水加至0.2gA.2包被液(0.05mol/LpH9.6)Na?CO?NaHCO?蒸餾水加至gg

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