線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性檢測試劑盒實驗解決方案原理線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ又稱細胞色素C氧化酶，也是線粒體電子傳遞呼吸鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。CheKine?線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性，其原理是還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C生成氧化型細胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ酶活性?？蓽y動、植物組織和細胞樣本。自備耗材·酶標儀或可見分光光度計（能測550nm處的吸光度）·恒溫箱、制冰機、低溫離心機·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器或研缽試劑準備ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。工作液的配制：臨用前，將ReagentⅤ和ReagentⅥ依次轉移到ReagentⅣ中混合溶解，如果檢測樣本是哺乳動物來源，請置于37℃孵育5min；如果樣本是其他物種，則置于25℃孵育5min。用不完的試劑分裝后-20℃避光保存1周，禁止反復凍融。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，以保證酶的活力。線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ的提?。簻蚀_稱取0.1g組織或收集500萬個細胞，加入1mLReagentⅠ和10μLReagentⅢ，用勻漿器或研缽冰浴勻漿。離心勻漿液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的離心管中，舍棄沉淀。再次離心上清，11,000g，10min，4℃，沉淀即為提取的線粒體，用作第5步操作。(選做)上清液即為胞漿提取物，可作為樣本用于測定從線粒體泄漏的線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ，用于判斷線粒體提取效果。在沉淀中加入200μLReagentⅡ和2μLReagentⅢ，充分重懸沉淀，用于下一步線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ酶活性檢測。實驗步驟酶標儀和可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至550nm，可見分光光度計用去離子水調零。在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入200μL工作液和10μL樣本，充分混勻后，立即讀取550nm處0min的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。注意：1.為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果ΔA過高（高于1.0），可用ReagentⅡ稀釋樣本后再測定，計算結果時注意乘以稀釋倍數。若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高檢測數值，若ΔA出現負值，則說明樣本中不含復合體Ⅳ或已降解。2.線粒體呼吸鏈試劑盒是酶動力學原理的試劑盒，反應比較快，且反應趨于平衡之后，該可逆反應可能會出現負反應，建議如下：（1）樣本組數：2-3個左右，該酶促反應速度快，且為酶促反應，需要把握好起始時間點和反應后的時間點；（2）儀器提前預熱，且加樣可安排在酶標儀旁邊進行，加樣混勻后直接放入；（3）如果ΔA偏小，可增加樣本量（組織克重或者細胞數量），或者減少提取液用量；（4）樣本盡量新鮮提取，如果不能馬上使用，則把完整細胞或者分裝的組織保存在-80℃，一個月內使用；（5）工作液臨用前配制。3.該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1890的測定。結果計算注意：我們為您提供的計算公式，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。1.使用96孔板測定的計算公式(1)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。上清中線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活力的計算：上清的復合體Ⅳ活力(U/g鮮重)=[ΔA上清×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V樣)÷T=2,221×ΔA上清÷W沉淀中復合體Ⅳ活力的計算:沉淀中的復合體Ⅳ活力(U/g鮮重)=[ΔA沉淀×V反總÷(ε×d)×109]÷(W÷V重懸×V樣)÷T=444×ΔA沉淀÷W復合體Ⅳ總活力的計算：總復合體Ⅳ活力即為上清中線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活力與沉淀中線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活力之和?？倧秃象wⅣ活力(U/g鮮重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W(2)按細胞密度計算單位的定義：每1萬個細胞每分鐘催化降解1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活力(U/104cells)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V重懸×500)÷T=0.888×ΔAV反總：反應體系總體積，2.1×10-4L；ε：細胞色素C摩爾消光系數，19.1×103mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；109：單位換算系數，1mol=109nmol；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應時間，1min；ΔA上清：上清測定值；W：樣本重量，g；V提?。禾崛◇w系體積，1.01mL；ΔA沉淀：沉淀測定值；V重懸：重懸沉淀體積，0.202mL；500：細胞總數，500萬。2.使用微量玻璃比色皿進行測定的計算公式將上述計算公式中光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。結果展示實驗實例：取0.1g小鼠腦組織進行樣本處理，按照測定步驟操作，用96孔板測得：ΔA上清=A1-A2=0.4568-0.4446=0.0122，ΔA沉淀=A1-A2=0.4373-0.4188=0.0185按樣本質量計算得：上清中線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性(U/g鮮重)=2,221×ΔA上清÷W=2,221×0.0122÷0.1=270.962U/g沉淀中線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性(U/g鮮重)=444×ΔA沉淀÷W=444×0.0185÷0.1=82.14U/g則線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ(U/g鮮重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W=270.962+82.14=353.102U/g相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1850CheKine?線