造血干細胞移植

進展云南省腫瘤醫院血液科何明生博士11999年12月美國《SCIENCE》

人類干細胞研究

列入人類十大科學成就

榜首22003年度

十大科學進展中同樣涉及了干細胞，即鼠的胚胎干細胞在培養皿中既能發育成精子也能發育成卵子，有望發展出新一代的試管嬰兒技術。

3hematopoieticstemcellinPubMedItems1-500of5666312/5/20054干細胞移植進展

第一部分基礎理論第二部分實驗技術第三部分臨床移植51．骨髓造血干細胞的基本概念骨髓造血干細胞(hematopoieticstemcell,HSC)是指存在于骨髓中的一小群具有無限或較長期的自我更新能力,并具有多向分化潛能的原始造血細胞61．骨髓造血干細胞的基本概念傳統觀念認為HSC的生物學特征是：①具有高度增殖分裂能力；②能多向分化產生各系血細胞；③可移植性；④能自我更新(self-renew)，持久地維持正常造血功能。72.骨髓造血干細胞的研究歷史

82.骨髓造血干細胞的研究歷史9造血干細胞移植

在近30年里迅猛發展壯大至今

1990年，美國的Thomas因在骨髓移植中做出重要貢獻，從而共同獲得該年度的諾貝爾生理獎和醫學獎，這是臨床醫學首次獲得此項殊榮。103.造血干細胞的體外研究造血干細胞向紅細胞分化造血干細胞向粒細胞分化造血干細胞向單核細胞分化造血干細胞向淋巴細胞分化造血干細胞向血小板分化造血干細胞向NK細胞分化113.造血干細胞的體外研究造血干細胞還可向心肌細胞分化、肝細胞、神經組織細胞、血管內皮細胞等非血液細胞分化124．造血干細胞的體內特性骨髓造血干細胞來源于胚胎干細胞的成血－血管內皮細胞，經由卵黃囊、胎肝、胸腺、脾、最后到骨髓，在體內不斷增殖發育，產生髓系、紅細胞系和淋巴細胞系，逐步分化至各系成熟血細胞。4．造血干細胞的體內特性134．造血干細胞的體內特性骨髓造血干細胞在體內具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，不斷的產生髓系、紅系和淋巴系細胞。4．造血干細胞的體內特性14神經性疾病

南佛羅里達醫學院和佐治亞醫學院的研究人員在2003年美國神經年會上報告，將血液中的干細胞移植到卒中大鼠的大腦中能大大促進大腦的功能恢復。15神經性疾病巴西圣保羅大學的研究小組從30例脊椎損傷所致癱瘓患者的血液中抽取干細胞，再注入患者脊椎動脈血管，幾個月后，12例患者的癱瘓肢體恢復了知覺。16神經性疾病

我們與昆醫神經科學研究所的合作研究表明，骨髓的CD34+細胞移植對恢復全脊髓損傷有治療作用，相關論文正在審稿之中。17（HSC）向神經細胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

干細胞移植成為治療神經系統退行性疾病唯一可能有效的手段。但是，目前NSC移植還未廣泛用于臨床實踐中，原因主要有3點：NSC取材困難，需做開顱手術，對患者創傷較大，給患者帶來較大痛苦。再加上神經系統退行性疾病患者多為高齡者，故患者已經受不住神經干細胞移植。18（HSC）向神經細胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

NSC分離提純技術尚未成熟，想要得到一定數量一定純度的NSC困難較大。NSC較脆弱，易受各種因素的影響，即使分離提純出NSC，也很難斷定這些神經干細胞仍具有正常功能和特性，以及將這些“神經干細胞”注入神經系統后能否分化為一定數量的神經細胞。19（HSC）向神經細胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

與NSC相比HSC具有以下優點：1）HSC取材容易，無論是骨髓HSC還是外周血HSC的采集都具有創口小、患者痛苦小、安全性高的特點。2）HSC的分離提純技術已較為成熟，可較容易的得到一定數量一定純度的HSC。20（HSC）向神經細胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

3）對干細胞的認識首先從HSC開始，因此關于HSC的研究較NSC要深入得多。4）HSC呈懸浮狀態，再采集和培養等過程中損傷較小。21（HSC）向神經細胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

臨床價值可將HSC培養分化出“神經細胞”的特性及功能，將這些“神經細胞”注入神經系統病變局部，從而替代或部分替代受損神經細胞的功能治療神經系統疾病。HSC源自患者本人，既可以避免移植后免疫排斥反應，年齡的限制也可延長。22（HSC）向神經細胞（NC）分化及其治療脊髓損傷的研究

預期研究成果1、骨髓干細胞可誘導分化為具有神經細胞功能的細胞2、骨髓干細胞誘導分化的神經細胞對脊髓損傷有治療作用23第二部分

實驗技術241.問題①如何取得干細胞②如何體外培養干細胞③如何保持體外培養干細胞的生物學特性252.髓造血干細胞的培養原理骨髓造血干細胞的體外培養指在模擬體內生理環境等特定的體外條件下，進行干細胞的孵育培養，使之生存并生長。造血干細胞體外培養呈懸浮狀生長，無需底物支持。1.體外培養原理263.動物取材在置備細胞懸液之前須將目的細胞所在組織材料分散成單細胞。機械分離和酶學解離是將組織分散成單細胞最常用的方法。273.1細胞懸液的制備

介紹兩種方法：①在無菌條件下利用穿刺法從髂骨抽取骨髓，緩慢加入到比重為1.077g/㎝3的淋巴細胞分離液中，經密度梯度離心吸取白細胞層，多次離心后可得到骨髓單個核細胞（BMNC），重新懸浮在含有10U/ml肝素的RPMI-1640液中，制成細胞懸液。283.1細胞懸液的制備

介紹兩種方法：②無菌條件下從髂骨抽取骨髓經輸血濾網過濾后，自然沉淀，去除大部分紅細胞，再以200r/min低速離心，漂洗2～3次去除血漿，保留有核細胞。

然后加入到RPMI-1640液中，制成密度為（1～5）×107MNC/ml的細胞懸液。293.2培養方法兩種常用的干細胞分離方法:1、免疫親和柱分離法2、免疫磁珠分離法301）免疫親和柱分離法具體方法如下：取收集的單核細胞置于RPMI1640培養液中，并加入胎牛血清過夜，以除去貼壁的細胞，在形成玫瑰花環的細胞中直接加入生物素標記的抗-CD34單克隆抗體，于4℃條件下旋轉孵育30分鐘，然后用Hanks液清洗。311）免疫親和柱分離法將結合好的細胞放入親和層析柱中，通過親和素和生物素的結合作用，標記的細胞被親和柱吸收，清洗親和柱除去非特異結合的細胞，即可獲得CD34＋細胞。322）免疫磁珠分離法此法特異性高、純度好、簡便快速、可以處理大量的細胞樣品以滿足臨床移植的需要。33c磁珠準備從被覆綿羊抗小鼠IgG1（Fc）抗體DynabeadsM-450的小瓶中（磁珠密度4×108/ml，30mg/ml），按0.5個磁珠/MNC的比例取出預計磁珠量，用RPMI/HAS漂洗后將磁鐵置于試管外壁吸引2分鐘，棄去上清液，收集磁珠，加入RPMI/HAS/IG1ml懸浮磁珠，置于冰浴中，立即使用。34d致敏細胞用CD34單克隆抗體（9C5）按0.5μg/106細胞比例致敏細胞，MNC濃度為（1～5）×107MNC/ml，混合均勻后置于4℃的旋轉混合器上以4r/min的速度低速轉動孵育30～60分鐘，用RPMI/HAS清洗細胞后4℃低速離心5分鐘，去除未結合的單克隆抗體，最后將致敏細胞加入RPMI/HAS中形成細胞懸液。35e混合按磁珠與致敏細胞0.5:1的比例將致敏細胞與磁珠結合，在4℃旋轉混合物器上轉動混合30分鐘，用磁鐵在管壁外吸引，收集磁珠-玫瑰花環形成細胞，再用RPMI/HAS漂洗，除去非玫瑰花環形成細胞。363）培養造血干細胞的常用方法①液體懸浮培養法②體外集落形成實驗

③骨髓基質細胞培養法

④微載體-微囊培養技術374.鑒定結果

一般采用脾結節形成測定法，計數脾臟的結節數一個造血干細胞增殖分化成一個集落，通常植入的造血干細胞數與生成的脾結節數呈線性相關。384.鑒定結果

采用造血干細胞表面標志即分化抗原的鑒定造血干細胞。如CD34分子、血管內皮生長因子受體2（VEGFR-2,又稱KDR）CD133（AC133）分子。39體外細胞的生長過程體外細胞培養的過程大致分為原代培養期、傳代期和衰退期三個階段。

原代培養期：細胞自體內新鮮組織取出并在體外培養生長至第一次傳代的時期，約持續1～4周。此期細胞活動較活躍40體外細胞的生長過程傳代期：原代培養的細胞生長至一定時間后，達到較高密度，此時應將原代細胞接種至其他培養皿中，此過程稱為傳代。衰退期：此期細胞仍在生存，但增殖很慢或不增殖。細胞形態輪廓增強，直至衰退死亡。41培養細胞的傳代生長過程細胞傳一代經歷四個階段：滯后期對數生長期穩定期衰退期42滯后期

包括懸浮期和潛伏期。細胞的胞質收縮，包體呈圓球狀，懸浮于培養基中。經過一段時間的培養，有活力的細胞開始附著于底物并逐漸延伸，恢復原來的形態，但還不分裂增殖。正常細胞的滯后期約為24～96小時。43對數生長期細胞增殖旺盛，開始階段細胞的增長速率與最初細胞數成正比，此時細胞數量呈指數增長。此期持續時間的長短因細胞本身的特性和培養條件而異，一般持續3～5天。44穩定期此期細胞雖仍保持分裂增殖能力，但增殖的細胞數與死亡的細胞數相當，從而處于一種動態平衡的狀態。45衰退期處于穩定期的細胞如不傳代或不加入新的培養基，則會進入衰退期，逐漸死亡。此期死亡細胞數超過分裂細胞數，細胞數因此逐漸減少。46培養細胞的細胞周期

G1期發生在上一細胞周期的M期之后，此細胞周期S期之前，有稱為細胞分裂后期。在G1期主要發生與DNA合成前有關的生化變化。S期此期主要進行DNA的合成，各種細胞的S期持續時間的差別較小，一般為6～8小時。47培養細胞的細胞周期

G2期發生在DNA合成后或細胞分裂前，有稱細胞分裂前期。G2期持續時間較短，一般為2～3小時。M期即細胞分裂期。處于分裂期的細胞是評價細胞增殖和生長能力的參考指標。此期持續時間很短，一般只有1～2小時485.注意事項污染預防和處理培養基成分培養基的酸堿度495.注意事項另外①接種細胞應處于對數生長狀態。處于靜止期的細胞在新鮮培養基中開始階段生長緩慢或根本不生長。505.注意事項②細胞接種前，培養基要預先加熱至37℃，培養基的PH用CO2預先平衡。③細胞的接種密度要大于1×105/ml。51

5.注意事項④攪拌速度在100～300r/min的范圍內，能夠保持細胞處于均勻的懸浮狀態即可。⑤至少每天取樣一次，檢測細胞的生長狀況和計數細胞密度。52

第三部分

臨床移植531.1移植的基本概念對患者進行超大劑量化療和（或）放療以摧毀患者的造血和免疫功能，同時最大限度的殺滅腫瘤細胞，然后輸入正常供體的造血干細胞或預先采集的患者自體造血干細胞，以重建患者的造血和免疫功能，稱為造血干細胞移植技術。541.1移植的基本概念造血干細胞主要存在于單個核細胞中，表達CD34抗原。CD34+細胞占單個核細胞的1%～4%。大量研究提示，CD34+HSC源于CD34-HSC，即CD34-細胞才是真正的造血干細胞。551.2骨髓移植的分類

自體骨髓造血干細胞移植（AHSCT）.同基因造血干細胞移植,即單卵孿生同胞（identicaltwin）供髓。561.2骨髓移植的分類

異基因造血干細胞移植（Allo-HSCT），包括：HLA相合或半相合的同胞供髓；HLA相合或部分相合的相關供髓；HLA相合或部分相合的無關供髓。571.3骨髓移植前的準備最重要的是移植患者的準備58①系統檢查及注意事項a．原發病狀況b．心，肺，肝，腎功能c．糖代謝功能d．口腔科檢查此外，應去處隱性感染灶，如耳、鼻、喉、肛周等處的病灶。59②全環境保護全環境保護（tTEP）包括口服腸道不吸收抗生素（常用抗生素有黃連素、慶、無菌飲食、皮膚清潔消毒和眼、耳、鼻、口腔、臍、陰道等部位的消毒；住空氣層流病房（LAFR）等。60②全環境保護TEP的時間應持續10～14天左右，其目的是盡量減少患者體內致病菌的負荷，從而最大限度地降低骨髓移植后感染的發生率。61③移植前預防感染的措施清除感染灶及體內已存在的病原體，以防預處理激活體內已存在的病原體。a．細菌感染的預防b．真菌感染的預防c．病毒感染的預防621.4供者的選擇骨髓移植供髓者的選擇關系到骨髓移植的方法、預處理方案、移植后處理及預后等。631.4供者的選擇供受者之間HLA相合與否直接影響著造血干細胞移植的成敗，所以通過HLA的檢測來篩選供者。641.4供者的選擇HLA基因系統是人類主要組織相容性復合體。由一系列緊密連鎖的基因坐位所組成的HLA系統構成了人體生物學的“身份證”。651.4供者的選擇個體的免疫活性細胞均以HLA作為識別“自己”與“非己”的標志，從而通過免疫反應排除“非己”，保持“自體”的完整性。661.5移植免疫學現代醫學三大支柱：1、神經生物學：解決生物信息如何傳遞問題2、分子免疫學：認識自己和排斥異己的問題3、分子生物學：研究分子機制的方法和工具671.6骨髓造血干細胞的采集麻醉抗凝采髓前準備骨髓采集采髓部位為髂后上棘，多點穿刺，分次采取。采集的有核細胞數應＞2×108/kg，CD34+細胞應＞2×106/kg。1.5骨髓造血干細胞的采集681.7預處理移植前的預處理是指移植前14天到移植時給予患者的化學藥物治療及放射治療。691)目的①最大限度的消滅患者體內的異常克隆或腫瘤細胞，減少復發；②破壞患者免疫系統，為造血干細胞的植入提供條件，防止排斥反應；③清除異常細胞，為造血干細胞及基質細胞的植入和增殖提供必要的空間。1)目的701)目的①最大限度的消滅患者體內的異常克隆或腫瘤細胞，減少復發；②破壞患者免疫系統，為造血干細胞的植入提供條件，防止排斥反應；③清除異常細胞，為造血干細胞及基質細胞的植入和增殖提供必要的空間。1)目的71①用于消除白血病細胞或腫瘤細胞的措施全身照射（TBI）+化療不含TBI的聯合化療72②抗腫瘤化學藥物

幾乎所有的抗白血病藥物均可用于白血病患者骨髓移植的預處理73③用于抑制受者免疫功能的藥物a．抗淋巴細胞球蛋白（ALG或ATG）b．全淋巴結照射（TLI）c．最常用藥物有環孢菌素(CSA)741.8移植并發癥1)造血和免疫功能受抑2)出血性膀胱炎3)間質性肺炎751.8移植并發癥

4)肝靜脈閉塞病5)移植物抗宿主病（GVHD）和移植排斥反應6)晚期并發癥762．骨髓造血干細胞移植的臨床應用血液病1、血液腫瘤白血病2、非血液腫瘤再生障礙性貧血2．骨髓造血干細胞移植的臨床應用772．骨髓造血干細胞移植的臨床應用非血液病1、實體瘤1）乳腺癌2）小細胞肺癌3）生殖腺腫瘤2．骨髓造血干細胞移植的臨床應用78HSCandlungcancer

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HSCandbreastcancer

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12/5/2005

（fromPubMed）

792．骨髓造血干細胞移植的臨床應用4）神經母細胞瘤5）其他進行造血干細胞移植的實體腫瘤還有腦膠質瘤、結腸癌、胃癌、胰腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、肉瘤、鼻咽癌等，有效率0～100%不等。2、自身免疫性疾病2．骨髓造血干細胞移植的臨床應用803.移植適應癥的擴大與縮小1998年美國學者Goldman等干細胞移植的適應癥分成4類：①