ICS13.060.99DB21水質底棲動物鑒定DNA條形碼法WaterQuality—IdentificationofMacrobenthos—DNABarcoding2023-08-30發布遼寧省市場監督管理局發布DB21/T3794—2023 2規范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 5方法原理 6試劑和材料 7儀器和設備 8樣品 9分析步驟 10結果計算 11質量保證與質量控制 12廢物處理 13注意事項 附錄A（資料性）序列搜索與比對 9附錄B（資料性）進化樹的構建與遺傳距離的計算 11 DB21/T3794—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由遼寧省生態環境廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省生態環境監測中心。本文件主要起草人：丁振軍、李楊、姜永偉、王星蒙、問青春、王秋麗、張爽、胥學鵬、張崢、盧雁。本文件為首次發布。本文件發布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省生態環境廳（遼寧省沈陽市渾南區雙園路30甲聯系電話文件起草單位通訊地址：遼寧省生態環境監測中心（遼寧省沈陽市渾南區雙園路30甲-3聯系電話1DB21/T3794—2023水質底棲動物鑒定DNA條形碼法警告：EB溶液具有遺傳毒性，操作時應按規定要求佩戴防護器具，避免接觸皮膚和衣物。本文件規定了利用DNA條形碼技術鑒定底棲動物的方法。本文件適用于河流、湖泊和水庫中底棲動物的鑒定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T30989高通量基因測序技術規程HJ710.8生物多樣性觀測技術導則淡水底棲大型無脊椎動物T/CSES81淡水生物監測環境DNA宏條形碼法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1底棲動物macrobenthos指生活史的全部或至少一個時期棲息于水體底部或底部基質中的不能通過0.5mm（40目）孔徑網篩的無脊椎動物。[來源：HJ710.8-2014，3.2，有修改]3.2細胞色素c氧化酶亞基IcytochromecoxidasesubunitI，COI后生動物線粒體基因組上的線粒體細胞色素c氧化酶亞基I對應的DNA序列。[來源：T/CSES81-2023，3.7，有修改]3.3引物primer在DNA復制過程中，結合于模板鏈上并作為復制延伸的起始位點和/或終止位點的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。[來源：GB/T30989-2014，3.11]3.4退火annealing模板雙鏈DNA經熱變性、雙螺旋解開成單鏈后，通過緩慢冷卻到特定溫度，使引物與該模板DNA2DB21/T3794—2023單鏈重新配對，形成新的雙鏈分子的過程稱為退火。3.5聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction，PCR模板DNA先經高溫變性為單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上的一段互補序列發生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以四種dNTP為底物，使退火引物得以延伸，如此反復變性、退火和DNA合成這一循環，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數擴增。[來源：GB/T30989-2014，3.14]3.6降落PCRtouchdownPCR，TDPCR一種退火溫度逐漸降低的多循環PCR反應程序。由于前期退火溫度高，引物結合難度增大，錯配幾率降低，目的片段的產率較低但準確率較高。后期隨著退火溫度的降低，前期積累的正確目的片段會被大幅擴增，使最終產物中目的片段的特異性大幅提高。3.7序列比對sequencealignment指運用特定的算法檢測兩個或多個序列之間的相似性，用于發現生物序列中的功能、結構和進化的信息。3.8遺傳距離geneticdistance遺傳距離指不同的種群或種之間的基因差異的程度，并以數值進行度量。3.9生物大分子序列比對搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST一種基于局部比對算法的搜索工具，可將輸入的核酸或蛋白質序列與數據庫中的已知序列進行比對，獲得序列相似度等信息，從而判斷序列的來源或進化關系。3.10分子進化遺傳分析工具MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA一種用于分析物種親緣關系、分子功能、遺傳進化等的工具。可以實現序列比對和調參建樹等功能。4縮略語下列縮略語適用于本文件。EB——溴化乙錠（Ethidiumbromide）DNA——脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）COI——細胞色素氧化酶亞基I（cytochromecoxidasesubunitI）PCR——聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）BLAST——生物大分子序列比對搜索工具（BasicLocalAlignmentSearchTool）MEGA——分子進化遺傳分析工具（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）DB21/T3794—20235方法原理酚作為蛋白質變性劑使蛋白質變性，SDS將細胞裂解，蛋白酶K消化蛋白質成多肽，使DNA從蛋白質中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機溶劑，離心后有機相在下層，DNA存在于上層水相中，蛋白質則沉淀于兩相之間，從而分離得到總DNA。PCR反應可特異性的擴增正向引物和反向引物間的序列，經35次循環，目標COI序列可被擴增約235倍。與DNA結合的EB會被紫外光激發發出強烈的橙紅色熒光，比未結合的EB熒光強度高幾十倍，從而擴增的COI序列可被檢測到。獲得的COI序列經測序在NCBI或BOLD等公共數據庫中搜索相似序列。將測序結果與搜索得到的序列一起繪制NJ進化樹并計算遺傳距離，一般遺傳距離小于0.02cM的認為是同一種。DNA條形碼法鑒定底棲動物流程圖見圖1。 圖1DNA條形碼鑒定底棲動物流程圖6試劑和材料6.1無菌水：去離子水121℃滅菌。6.2無水乙醇（C2H6O）。6.370%乙醇。6.4乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA，C10H146.5三羥甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3）。6.6十二烷基硫酸鈉（SDS，C12H25SO4Na）。6.710%SDS溶液：稱取SDS10g，加入約60mL去離子水，加熱溶解，用濃鹽酸調節pH至7.2，去離子水定容至100mL，常溫備用。6.8三氯甲烷（CHCl3）。6.9Tris飽和酚溶液（pH7.7～8.1，市售）。6.10蛋白酶K溶液：400U/mL（市售）。6.11EB儲存液：10mg/mL（市售）。6.12EB工作液：吸取10μLEB儲存液加入200mL去離子水中，混勻，終濃度為0.5μg/mL。6.13瓊脂糖（標準熔點）。4DB21/T3794—20236.141%瓊脂糖凝膠：稱取0.3g瓊脂糖，加入30mL去離子水，微波爐加熱至恰好全部熔化，立即倒入制膠槽中，插入制膠梳，臨用現制。可根據制膠槽大小適當調整瓊脂糖凝膠的制備量。6.151×TE緩沖液：6.1650×TAE緩沖液（市售）。6.171×TAE緩沖液：取20mL50×TAE緩沖液，去離子水定容至1L，常溫備用。pH緩沖范圍7.8～8.8。6.186×蔗糖凝膠上樣緩沖液：含溴酚藍、EDTA（市售）。6.192×TaqPCRMix預混液：含TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液和溴酚藍（市售）。6.20DNA分子量標準（含上樣緩沖液，市售100bp～2000bp，包含6條單一DNA條帶，分別為：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。6.21PCR引物：LCO1490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGHCO2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA）。7儀器和設備7.1天平：準確到0.001g。7.2干式恒溫器：56℃可調。7.3PCR儀：PCR反應程序可編輯。7.4水平電泳儀：電壓100V可調。7.5離心機：12000r/min可調。7.6凝膠成像儀：具有紫外成像功能。8樣品8.1樣品采集底棲動物的采集按照HJ710.8相關規定執行。8.2樣品保存底棲動物樣品采集后，用無水乙醇沖洗干凈，保存于無水乙醇中，冷凍條件下可長期保存。現場無冷凍條件的，應4℃冷藏保存并盡快送到實驗室轉為冷凍保存，冷藏條件保存不應超過3天，以防DNA發生分解。9分析步驟9.1總DNA的提取組織樣本宜取自底棲動物肌肉部位，該部位線粒體豐富，易于獲得較好的擴增效果。可選取底棲動5DB21/T3794—2023物個體腿部或胸部組織，如底棲動物個體較小（如搖蚊幼蟲可將整個個體放入EP管中進行總DNA提取。取約25mg組織樣本，用無水乙醇反復清洗數次，濾紙吸干，放入1.5mLEP管中，加入500μLTE緩沖液（6.15100μL10%SDS溶液（6.720μL蛋白酶K（6.1056℃恒溫2h～4h至完全消化，消化前期應不時搖晃EP管，使管內溶液混勻。消化完成后，加入Tris飽和酚（6.9）600μL，混勻10min，12000r/min離心10min。取上清液加入1/2體積的三氯甲烷（6.8）、1/2體積的Tris飽和酚，混勻10min，12000r/min離心10min。取上清液加入相同體積的三氯甲烷，混勻10min，12000r/min離心10min。取上清液加入2倍體積的預冷至4℃的無水乙醇，-20℃沉淀1h～2h，12000r/min離心10min，小心倒掉上清液。使用預冷至4℃的70%乙醇400μL清洗雜質，輕微搖晃1min，12000r/min離心2min，棄去上清液。再次使用預冷的70%乙醇400μL清洗雜質，12000r/!存-20℃沉淀圖2總DNA提取流程圖也可使用市售試劑盒提取總DNA，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。建議優先選用市售試劑盒提取。9.2總DNA的電泳檢測提取的總DNA應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以判斷總DNA提取情況。1%瓊脂糖凝膠（6.14）制備完成后連同制膠槽一同放入電泳槽TAE緩沖液中，上樣孔放置于電泳儀6DB21/T3794—2023負極方向，并使緩沖液液面略微超過凝膠上表面。吸取2.5μLDNA分子量標準（6.20）小心加入到第一個上樣孔中；總DNA樣品和6×蔗糖凝膠上樣緩沖液（6.18）按5:1混合均勻，吸取2.5μL混合后的樣品加入空上樣孔中。計算電泳槽正負極間的距離，調節電泳儀，使電壓不超過5V/cm～8V/cm。開始電泳，當溴酚藍染料條帶移動至凝膠約2/3位置時，電泳結束。9.3EB染色將結束電泳的瓊脂糖凝膠從制膠槽中取出，放入EB染色液（6.12）中，使EB染色液沒過凝膠，染色30min。取出后清水漂洗兩次。注：也可使用其他染料替代EB，具體使用方法參見相關試劑說明書。9.4總DNA的凝膠成像將染色并漂洗后的凝膠放入凝膠成像儀中，紫外成像拍照，與DNA分子量標準對比，提取的總DNA大小一般大于2000bp。9.5PCR擴增此階段共30次循環；再以45℃為退火溫度循環5次。整個PCR過程共計35次循環。PCR反應體系和PCR反應程序見表1和表2。表1PCR反應體系加入量(μL）12324257DB21/T3794—2023表2PCR反應程序54——9.6擴增產物的電泳檢測擴增產物按步驟9.2進行電泳檢測。9.7EB染色擴增產物電泳結束后按步驟9.3進行EB染色。9.8PCR擴增產物的凝膠成像染色并漂洗后的凝膠按步驟9.4進行PCR擴增產物的凝膠成像分析。9.9測序擴增的COI序列可委托專業測序公司進行基因測序，測序結果文件為fasta格式。10結果計算10.1序列搜索與比對測試樣品的測序結果在NCBI等國際公共數據庫中BLAST搜索相似序列，一般要求相似性大于95%，將搜索得到的一條或多條相似序列與測序結果一起在MEGA等軟件中進行序列比對（附錄A）。10.2繪制NJ進化樹并計算遺傳距離比對完成后的結果使用Kimura2-parameter（K2P）模型，自展值（Bootstrap）不低于1000，繪制NJ進化樹，計算遺傳距離（附錄B）。10.3結果判讀若進化樹上測試樣品與搜索得到的序列聚為一支，且遺傳距離小于0.02cM，即可判定測試樣品與該序列為同一物種。11質量保證與質量控制11.1實驗前的分類鑒定每次實驗前應先對物種進行目或科的簡單分類鑒定。11.2平行樣的測定每次實驗需開展平行雙樣測試，兩次鑒定結果需完全相同，否則應查找原因并重新測試。8DB21/T3794—202312廢物處理對于廢棄的EB溶液可做如下處理：對于EB含量大于0.5mg/mL的溶液，將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/mL。加入一倍體積的0.5mol/LKMnO4，混勻，再加入等量的2.5mol/L鹽酸，混勻，置室溫數小時。加入一倍體積的2.5mol/LNaOH，混勻后按有毒有害廢物處理。對于EB含量小于0.5mg/mL的溶液，按1mg/mL的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時。用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后按有毒有害廢物處理。13注意事項EB具有毒性，實驗室內應劃分清潔區與EB污染區。實驗時應帶好手套等防護措施，若沾染EB后應使用大量清水清洗。9DB21/T3794—2023（資料性）序列搜索與比對A.1序列搜索序列搜索在NCBI網站（/）上進行，選擇“Resources—DNA&RNA—BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）”，然后點擊“NucleotideBLAST”按鈕（圖A.1進入到序列搜索界面。在搜索框中輸入需要搜索的測序結果序列，點擊“BLAST”搜索相似序列（圖A.2以“.fasta”格式下載搜索結果列表（圖A.3）中相似度最高的序列進行比對。圖A.1NucleotideBLAST界面圖A.2BLAST搜索序列界面DB21/T3794—2023圖A.3BLAST搜索結果界面A.2序列比對將測序結果序列與搜索得到的序列放在同一個fasta文件中，在MEGA軟件中打開該fasta文件，選擇“AlignbyClustalW”進行序列比對，比對結果（圖A.4）另存為“.meg”格式進行進化樹的構建和遺傳距離的計算。圖A.4序列比對結果界面DB21/T3794—2023（資料性）進化樹的構建與遺傳距離的計算B.1進化樹的構建將比對完成并保存的meg文件加載進MEGA軟件，點擊“Construct/TestNeighbor-JoiningTree”，選用“Bootstrapmethod”，自展值至少為1000次，模型選擇“Kimura2-parametermodel”（圖B.1點擊“OK”開始構建進化樹。構建的進化樹如種類過多矩形樹無法全部顯示，可選用圓形樹展示（圖B.2觀察測試樣本與搜索到的樣本的聚類情況。圖B.1使用K2P模型構建NJ進化樹的設置界面DB21/T3794—2023圖B.2使用K2P模型構建的NJ進化樹B.2遺傳距離的計算點擊“ComputePairwiseDistances”，同樣選用“Bootstrapmethod”，自展值至少為1000次，模型選擇“Kimura2-parametermodel”（圖B.3點擊“OK”開始計算遺傳距離。圖B.3基于K2P模型計算的遺傳距離DB21/T3794—2023參考文獻[1]HJ710.8-2014,生物多樣性觀測技術導則淡水底棲大型無脊椎動物[S].[2]ArnotDE,RoperC,BayoumiRAL.DigitalcodesfromhypervariabletandemLyrepeatedDNAsequencesinthePlasmodiumfalciparumcircu