學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精課題3血紅蛋白的提取和分離課前預習情景導入血紅蛋白的功能是運輸氧.而亞硝酸鹽進入人體，可生成強致癌物亞硝酸胺，也可與人體血液中的血紅蛋白結合，使人產生缺氧病癥，典型事例便是被列為世界十大環境污染事故之一的1952年美國洛杉磯光化學煙霧事件。該事件致使大批居民發生眼睛紅腫、喉痛咳嗽、皮膚潮紅等癥狀，嚴重者心肺功能衰竭,有400余名65歲以上的老人因此而死亡。此外，植物大面積受損，車禍增多。血紅蛋白又是如何提取的呢?本課題將告訴你蛋白提取的秘密。知識預覽一、基礎知識1.凝膠色譜法（1）概念：凝膠色譜法也稱作，是根據分離蛋白質的有效方法。(2）原理：大多數凝膠是由構成的小球體，內部有許多貫穿的通道，當不同的蛋白質通過凝膠時,的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程______，移動速度______；而的蛋白質無法進入凝膠內部的通道,只能在移動，路程,移動速度。相對分子質量不同的蛋白質因此得以分離.2.緩沖溶液(1)作用：在一定范圍內，緩沖溶液能抵制對溶液______的影響，維持pH基本不變。（2）配制：通常由種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節緩沖劑的______________就可以制得的緩沖液.3。電泳（1)概念：帶電粒子在的作用下發生的過程。(2）原理：許多重要的生物大分子，如______、______等都具有的基團，在一定pH下，這些基團會帶上______或______。在電場的作用下，這些帶電分子會向著______________________移動。電泳利用了分離樣品中各種分子以及分子本身的______、______不同，使帶電分子產生不同的，從而實現樣品中各種分子的分離。答案：1。（1）分配色譜法相對分子質量的大小(2)多糖類化合物相對分子質量較小較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快2.（1）外界的酸和堿pH（2）1～2使用比例不同pH范圍內使用3。（1）電場遷移（2）多肽核酸可解離正電負電與其所帶電荷相反的電極帶電性質差異大小性狀遷移速度二、實驗操作蛋白質的提取和分離一般分為四步：、、和。1。樣品處理血紅蛋白由______肽鏈組成，包括兩個和兩個.每條肽鏈環繞一個基團，此基團可攜帶或。血紅蛋白因含有血紅素而呈現。（1）紅細胞的洗滌①目的：去除。②方法：離心，如500r·min-1離心2min,然后用膠頭吸管吸出上層透明的，將下層的紅細胞液體倒入______，再加入的生理鹽水,緩慢攪拌______,低速短時間離心，如此重復洗滌______，直至上清液中沒有______,表明紅細胞已洗滌干凈。（2）血紅蛋白的釋放：將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中,加到原血液的體積，再加40％的，置于上充分攪拌10min。(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合液離心后可觀察到試管中溶液分為4層：將液體用_______過濾，除去,于中靜置片刻后，分出下層的________液體。（4)透析：取1mL的溶液裝入中，將其放入盛有300mL的20mmol·L—1的中（pH=_______），透析12h。2。凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作①柱底部的制作Ⅰ.選擇合適的橡皮塞，中間打孔。Ⅱ.在橡皮塞頂部切出鍋底狀的_______，在0.5mL的頭部切下______長的一段,插入橡皮塞孔內，上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。Ⅲ。剪尼龍網小圓片覆蓋在。用大小合適的目的尼龍紗將橡皮塞_____________包好,插到玻璃管一端。Ⅳ.色譜柱下端用移液管頭部作，連接一細的，并用控制尼龍管的_________與________，另一端放入收集的收集器內。②柱頂部的制作:插入安裝了玻璃管的橡皮塞。(2)凝膠色譜柱的裝填①填充材料：交聯葡聚糖凝膠。②方法:凝膠用充分溶脹后，配成,在與色譜柱下端連接的尼龍管打開的情況下，一次性緩慢倒入.裝填完后，立即連接，在高的操作壓下,用300mL的20mmol·L—1的磷酸緩沖液充分平衡凝膠12小時，使凝膠裝填。(3）樣品的加入和洗脫①加樣前：打開流出口，使柱內凝膠面上的下降到與平齊，關閉出口。②加樣：用_______將1mL的樣品加到色譜柱的_______.③加樣后：打開,使樣品滲入凝膠床內,等完全進入后，關閉下端出口。小心加入緩沖液到__________，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫，待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每收集一管，連續收集。3。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷_____的蛋白質是否達到要求，需要進行蛋白質的鑒定.答案:樣品處理粗分離純化純度鑒定1。四條α肽鏈β肽鏈亞鐵血紅素一分子氧一分子二氧化碳紅色（1）①雜蛋白②低速短時間黃色血漿暗紅色燒杯五倍體積10min三次黃色（2)蒸餾水甲苯磁力攪拌器（3）無色透明脂溶性物質白色血紅蛋白紅色暗紅濾紙脂溶性沉淀層分液漏斗紅色透明（4）血紅蛋白透析袋磷酸緩沖液702。(1)①Ⅱ凹穴移液管