2灰色鏈霉菌的活化一、試驗目的一、試驗目的學習制備高氏一號斜面培育基的方法以及斜面接種技術。二、試驗原理二、試驗原理高氏一號斜面培育基是一種合成培育基，用于培育放線菌。三、試驗試劑與儀器三、試驗試劑與儀器菌種：灰色鏈霉菌；0.01g，瓊脂20g，水1000毫升，PH7.2—7.4〔配制時留意，可溶性淀粉要先用冷水調勻后再參加到以上培育基中；器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、紗布、18mL×180mL試管、棉花、電爐、燒杯、記號筆、酒精燈、接種環等。四、試驗環節四、試驗環節高氏一號培育基的制備〔1〕按配方稱量藥品，加熱攪拌至瓊脂完全熔化，補水至1000mL。趁熱分裝于18mL×180mL8mL為宜。〔3〕分裝完畢后，塞好棉塞并將試管捆扎好。高壓蒸汽滅菌：121℃滅菌20min，滅菌后趁熱擺斜面。斜面接種無菌室內，超凈工作臺或試驗臺酒精燈火焰旁進展。左手拿試管菌種，右手拿接種環，先將金屬環燒灼滅菌，再將接種環在空白培育基處冷卻，挑取菌落，在火焰旁稍等半晌。左手將試管菌種放下，拿起斜面培育基。在火焰旁用右手小指和手掌邊沿拔下棉壁。灼燒試管口，在火焰旁將棉塞塞上。接種完畢，接種環上的余菌必需灼燒滅菌后才能放下。285～6d觀測結果。試驗3 灰色鏈霉菌的搖瓶種子制備一、試驗目的一、試驗目的學習制備搖瓶種子培育基的方法以及種子擴大培育技術。二、試驗原理二、試驗原理枯燥管中處休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后培育,最終獲得肯定數量和質量的純種過程。其目的一方面是出于接種量的需要與菌種的馴化，同時對于縮短發酵時間、保證生產水平也有幫助。種子擴培的一般過程是：斜面菌種→一級種子培育〔搖瓶〕→二級種子培育(種子罐)→發酵性、接種量的影響。搖瓶培育技術問世于本世紀30年月，由于其簡便、有用，廣泛用于微生物菌種篩選、的優化。在搖瓶培育過程中振蕩的目的在于改善活細胞的氧氣和養分物的供給或許是格外顯著的，且各自存在一最適濃度。三、試驗試劑與儀器三、試驗試劑與儀器菌種：灰色鏈霉菌〔由試驗二活化得到；20g40g5g5g3g0.25g，0.2g4g1000mL、pH7.2-7.4。器材：天平、500mL250mL三角瓶、棉花、電爐、燒杯、記號筆、酒精燈、接種環等。四、試驗環節四、試驗環節搖瓶種子培育基的制備取干凈三角燒瓶，250ml三角瓶分裝培育基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮紙包0.1MPa45-60min。接種將活化的菌種斜面，在無菌的條件下，注入10mL無菌水，震蕩成孢子懸浮液〔孢子濃度約為8104個/m。待發酵培育基滅菌后冷卻到28℃時，分別將孢子懸浮液接入三角瓶2mL，標好記號。培育與觀測28℃、200r/min24h，觀測菌絲體形態及濃度。試驗4 灰色鏈霉菌搖瓶發酵一、試驗目的學習和把握搖瓶發酵培育的原理和方法。二、試驗原理或者抑制結核桿菌生長的作用。N－甲基-L-葡萄糖胺構成的糖苷，其構造式如下。鏈霉素中鏈霉糖局部的醛基被復原成伯醇基后，就素的硫酸鹽。277天。待斜面長滿孢子后，制成懸浮液接入裝有培育基的搖瓶中，于27℃下培育45～48小時待菌絲生長旺盛后，取假設干個搖瓶，合并其中的培育液將其接種于種子罐內已滅菌的培育基中，通入無菌空氣攪拌，在罐溫2762～63小時，然后接入發酵罐內已滅菌的培育基中，通入無菌空氣，攪拌培育，在罐溫為27℃下，發酵約7～8天。②提取精制，發酵液經酸化、過濾，除去菌絲及固體物，然后中和，通過弱酸型陽離子互直接做成水針劑。三、試驗試劑與儀器三、試驗試劑與儀器菌種：灰色鏈霉菌搖瓶種子〔由試驗三獲得〕160g5g〔單獨滅菌MgSO40.5gNa2HPO41.6g、玉米漿25~35、FeS4和MnS4各20mg/，消泡劑0.31000m，pH7.。儀器：500m1三角燒瓶、旋轉式搖床等。四、試驗環節四、試驗環節搖瓶發酵培育基的制備取干凈三角燒瓶，250ml30ml8層紗布包扎瓶口，再加牛皮紙11520min。接種30℃時，按接種量8%~10%進展接種。培育與觀測32℃、100r/min旋轉式搖床培育36h~40h，發酵過程中，補加滅菌尿素以增長氮源，維pH值。五、思考題五、思考題觀測菌絲形態，用試紙測發酵液的pH值，并補加滅菌尿素。試舉例說明搖瓶培育技術的應用。試驗5 灰色鏈霉菌發酵產物活性測定一、試驗目的一、試驗目的學習和把握抗生素抑菌性能的測定方法。二、試驗原理二、試驗原理效價，其最小效價單元就叫做“單位”(U)“國際單位”(IU)。通常各種抗生素的單位，是依據國家抗生素標準品測定出來的，是衡量藥物有效成份的一種尺度。(活性局部)作為衡量的標準，因此，效價的凹凸是衡量抗生素養量的相對標準。以其有效局部的肯定重量〔多為1μg〕作為一個單位，如鏈霉素、土霉素、紅霉素等均以純1μg作為一個單位。少數抗生素則以其某一特定的鹽的1μg或肯定重量作為一個單1000單位/mg798單位/mg，金霉素和四環素均以其鹽1μg1單位，青霉素則以國際標準品青霉素G0.6μg1單位。抗生素的效價常承受微生物學方法測定的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法cylinderplatemetho。管碟法是依據抗生素在瓊脂平板培育基中的集中滲透作用〔內徑6.00.lm，外徑8.00.lm，高100.lm，管內放人標準品和檢品的溶液，經16~18比例〔2:1或4:1〕的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再依據抗生素濃度對數和4個小鋼管，管內分別放入檢品高、低劑量和標準品高、低劑量溶液。更能擬定抗生素的醫療價值；并且使用范圍廣，較純的精制品、純度較差的制品藥物效價測定的最根本方法。三、試驗試劑與儀器三、試驗試劑與儀器測定用指示菌：枯草芽孢桿菌[CCMCC(B) 63 501]儀器：分光光度計、離心機、培育箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、牛津小杯〔不銹鋼小管，內徑6.00.lm，外徑8.00.lm，高100.lm、培育皿等。培育基傳代用培育基〔用于枯草芽孢桿菌菌傳代和保藏：蛋白胨10，牛肉膏5.0g18g1000mL，pH7.2-7.5。生物測定用培育基〔培育基I〕蛋白胨5g，牛肉浸出粉3g，瓊脂15~20g，磷酸氫二鉀3g，蒸餾水1000mL，除瓊脂外混合上述成分調整PH值使比最終的pH值略高0.2-0.4，加人瓊脂加熱溶化后濾過，調整pH值使滅菌后為7.8 8.0，在115℃，滅菌30分鐘。試劑〔1〕標準鏈霉素〔標準品理論計算值為798.3u/m：0.6~1.6單位/mL〔2〕0.85%NaCl溶液〔生理鹽水〕100mL。〔3〕1%pH7.85.59g0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。四、試驗環節四、試驗環節1枯草芽孢桿菌菌懸液的制備將枯草芽孢桿菌接種于養分瓊脂培育基斜面，在35~37℃培育7天，用革蘭氏染色85%6530分鐘，備用。2上層培育基的預備將已滅菌的生物測定用培育基100mL，溶化后放入50℃恒溫水浴中，待溫度平衡后，參加枯草芽孢桿菌菌懸液5mL，充分搖勻，備用。平板的制作5020mL，水平放置，待凝固后用大口移液管吸入上層培育基5m，將培育皿來回傾側〔要快速均勻分布，凝固后備用，雙碟不得少于4個。放置小鋼管得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨便移動，要靜置5min，使之在瓊脂內稍下沉降穩定后，再開頭滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液滴加抗生素要依據SH→TH→SL→TL〔二劑量法，S代表標準品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度〕的挨次滴加，在一雙碟對角的2個不銹鋼小管中分別滴裝高濃度2的劑距為2:1或4:1。液面應當與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色〔抗生素液體參加量不能按滴計算，即使同一滴管，每滴的量也有差異〕假設抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片留神吸去多余局部。雙碟中菌株的培育14~16h。時間太短會導致抑菌圈模糊，太長則會使菌株對抗生不均勻〔過于接近熱源，會導致同一雙碟上細菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培育箱時，要與箱壁保持肯定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培育中，箱門不得隨便啟動，以免影響溫度。應常常留意溫度，防止意外過冷過熱。抑菌圈測量試驗結果中抑菌圈直徑不應當過大或者過小，在試驗之前，可以先做一個關于用不同濃度菌液配制的瓊脂培育基菌層預試驗，選擇抑菌圈直徑在18～2