DB32/T××××—2019PAGE3山羊副流感病毒3型檢測技術規程范圍本標準規定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3,CPIV3）的病原學檢測（病毒核酸的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測）、血清學檢測（血凝抑制（HI）試驗）的技術要求。本標準適用于山羊副流感病毒3型及其感染情況的實驗室檢測。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范病原學檢測3.1材料微量移液器及吸頭、DEPC水處理的離心管、吸頭、PCR擴增管、TRIzol試劑、三氯甲烷、異丙醇、DEPC處理水（用水符合GB/T6682規定）、反轉錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反應緩沖液、一步法熒光定量RT-PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR與探針（附錄A）。3.2儀器設備PCR儀、熒光定量PCR儀、臺式冷凍離心機、電泳儀和水平電泳槽、凝膠成相儀（或紫外透射儀）。3.3反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）3.3.1樣品處理與RNA的提取采集羊的鼻拭子、氣管拭子或肺臟（樣品的采集、保存和運輸應符合NY/T541相關規定）。取200μL待檢樣品液至無菌無RNA酶的EP管中，使用TRIzol試劑、RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等方法提取RNA。3.3.2RT-PCR反應RT-PCR反應使用20μL體系：10μL2×一步法RT-PCR反應緩沖液、引物MF/MR各0.5μL（10μmol/L）、0.4μL反轉錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC處理水。反應條件為：45℃反轉錄30min；94℃預變性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，進行35個循環；72℃延伸10min。3.3.3結果判定取PCR產物10μL，在1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在凝膠成像系統中觀察結果。樣品PCR檢測產物電泳后有大小為346bp的片段判斷為山羊副流感病毒3型核酸陽性，無條帶判斷為陰性。每次試驗應設置陰陽性對照，陰陽性對照應不出現或出現相應大小的條帶。3.4熒光定量反轉錄-聚合酶鏈式反應（熒光定量RT-PCR）3.4.1核酸提取與熒光定量RT-PCR反應核酸提取同3.3.1。熒光定量RT-PCR反應使用20μL體系：10μL2×一步法反應緩沖液，0.4μL反轉錄酶，0.4μLDNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4μL（10μmol/L），0.8μL探針，0.4μL染料，2μLRNA模板，5.2μLDEPC處理水。將PCR管置于熒光定量PCR儀器上進行RT-PCR擴增，程序如下：42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃34s，共進行40個循環。3.4.2熒光定量RT-PCR結果判定陽性對照擴增曲線呈標準的S曲線，且Ct值＜30。陰性對照擴增曲線應為基線下的水平線。若樣本曲線呈S形曲線，且Ct值＜38為陽性；未出現擴增曲線為陰性。血清學檢測——血凝抑制（HI）試驗4.1材料微量移液器及配套吸頭、96孔V型微量反應板、生理鹽水、1%豚鼠紅細胞懸液（配制方法見附錄B）、病毒液（相關試驗操作應符合GB19489的要求）、標準陽性血清、標準陰性血清。4.2儀器設備離心機、恒溫培養箱。4.3病毒血凝效價測定每次HI試驗前應對病毒血凝效價進行測定，檢測與判定方法如下：——在反應板一排各孔中加25μL生理鹽水；——第一孔中加25μL病毒分離液，按照1:2倍比稀釋，最后一孔不加抗原作陰性對照。每孔中再加25μLPBS；——每孔加25μL1%豚鼠紅細胞液，37℃孵育40min；——當紅細胞被凝集時，紅細胞均勻分布在反應板底部，反應板傾斜片刻，紅細胞不下滑；紅細胞未被凝集時，反應板傾斜片刻，可見沉淀的紅細胞向下滑動，形成流線。HA效價為全部紅細胞出現凝集時的最高稀釋倍數。4.4HI試驗按如下方法進行HI試驗：——在96孔V型微量反應板各孔中加25μL生理鹽水；——加25μL經處理的血清于第一孔中，混勻后取25μL加到第2孔中，依次倍比稀釋，從第2孔加至第11孔，第11孔混勻后吸取25μL棄去，最后1孔不加血清作為對照；——每孔中加25μL4個HA單位的病毒抗原，37℃孵育40min；——每孔加25μL1%豚鼠紅細胞液，37℃孵育40min。4.5結果判定將反應板傾斜70度左右，若無凝集反應，則沉淀的紅細胞向下滑動，呈流線狀，記錄為抗體陽性。完全抑制凝集的抗體最高稀釋倍數為血清的HI抗體滴度。抗體滴度大于等于16為陽性，小于等于8為陰性。若檢測發病后雙份血清（第一份血清應在臨床癥狀出現后立即采集，第二份血清在兩周后采集），抗體滴度上升4倍或4倍以上時，表明羊只近期被感染。

附錄A

（資料性附錄）

引物引物序列表A.1用于RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測的引物、探針引物靶基因序列（5’-3’）產物MFM基因AGTGATCTAGATGATGATCCA346bpMRM基因GTTATTGATCCAATTGCTGTqMFM基因GCTTGGCTTCTTTGAAATGG150bpqMRM基因GCCTGCAGAAGTTCCTTGTCCPIV3ProbeM基因FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA-TAMRA引物的溶解引物MF、MR、qMF、qMR用滅菌的DEPC處理水溶解到濃度為10μmol/L；CPIV3Probe用滅菌的DEPC處理水溶解到濃度為10μmol/L。

附錄B

（資料性附錄）

1%豚鼠紅細胞的配制B.1生理鹽水配制方法氯化鈉（NaCl）0.9g去離子水加至100mL，121℃高壓滅菌15min，冷卻后保存于2℃～8℃冰箱中備用。B.21%豚鼠細胞懸液制