血液中45種有毒生物堿成分的液相色譜-串聯質譜檢驗方法本技術規范規定了血液中45種有毒生物堿成分（見附錄A）的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）檢驗方法。本技術規范適用于血液中45種有毒生物堿成分的定性定量分析。也適用于尿液及體外樣品、可疑物證中45種有毒生物堿的定性分析。2規范性引用文件下列文件中對本技術規范的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本技術規范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本技術規范。GA/T122毒物分析名詞術語GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義GA/T122中界定的術語和定義適用于本技術規范。4原理本法利用45種有毒生物堿成分可在堿性條件下被有機溶劑從血液中提取出來的特點，以SKF525A為內標，用液相色譜-串聯質譜法的多反應監測(MRM)模式進行檢測，經與平行操作的有毒生物堿對照品比較，以保留時間、兩對母離子/子離子對進行定性分析；以定量離子對峰面積為依據，內標法或外標法定量。5試劑和儀器5.1試劑5.1.1乙腈。5.1.2甲酸：優級純。5.1.3甲醇。5.1.4乙醚：分析純。5.1.5乙酸銨。5.1.6超純水：由純水系統制得，電阻率>18.2MΩ·cm。5.1.7pH9.2硼砂緩沖液。5.1.8流動相緩沖液：20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液：分別稱取1.54g乙酸銨和1.84g甲酸置于1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值約為4。25.1.945種有毒生物堿對照品標準溶液：分別精密稱取45種有毒生物堿對照品各適量，用甲醇配成1.0mg/mL對照品標準儲備溶液，置冰箱中冷凍保存，保存時間為12個月。試驗中所用其它濃度的對照品標準溶液均從上述儲備液用甲醇稀釋而得。5.1.10內標物SKF525A對照品標準溶液：精密稱取SKF525A適量，用甲醇配制成1.0mg/mLSKF525A對照品標準儲備溶液，置冰箱中冷凍保存，保存時間為12個月。將儲備液用甲醇稀釋得5μg/mLSKF525A內標工作液，置冰箱中冷藏保存，保存時間為6個月。5.2儀器5.2.1液相色譜-串聯質譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。5.2.2分析天平：感量0.1mg。5.2.3渦旋混合器。5.2.4離心機。5.2.5精密移液器。5.2.6恒溫水浴鍋。6測定步驟6.1樣品預處理6.1.1待測樣品取待測血液1mL，加5μg/mLSKF525A內標工作液10μL，加1mLpH9.2硼砂緩沖液后，用乙醚3mL提取，渦旋混合，離心，將乙醚層轉移至另一試管中，同法提取兩次，合并乙醚液，置60°C水浴中揮干，殘留物用100μL流動相（乙腈∶流動相緩沖液=70∶30)定容，供LC-MS/MS分析。6.1.2空白樣品取空白血液1mL，按“6.1.1”項下進行操作和分析。6.1.3添加樣品取空白血液1mL，添加待測樣品中出現的可疑有毒生物堿對照品，按“6.1.1”項下進行操作和分6.2測定6.2.1液相色譜-串聯質譜儀參考條件a）液相色譜柱：CapcellPakC18（250mm根2.0mm，MGⅡ5μm）或相當者；b）柱溫：室溫；c）流動相：V(乙腈)∶V(流動相緩沖液)=70∶30；d）流速：200μL/min；e）進樣量：5μL；f）離子源：電噴霧電離-正離子模式(ESI+)；g）檢測方式：多反應監測（MRM）；h)離子源電壓（IS）：5500V；i）碰撞氣(CAD)、氣簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)、輔助氣2(GS2)均為高純氮氣，使用前調節各氣流流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；3j）各成分去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等電壓值應優化至最佳靈敏度（見附錄A）。6.2.2定性分析定性分析以兩對母離子/子離子對進行（見附錄A）。如果待測樣品出現某一有毒生物堿兩對母離子/子離子對的特征色譜峰，保留時間與添加樣品中相應對照品的色譜峰保留時間比較，相對誤差在土2%內，且所選擇的離子對相對豐度比與添加對照品的離子對相對豐度比之相對誤差不超過表1規定的范圍，則可認為待測樣品中檢出此種有毒生物堿成分。表1相對離子對豐度比的最大允許相對誤差(%)6.2.3定量分析6.2.3.1定量方法根據待測樣品中有毒生物堿的濃度情況，用空白血液添加相應有毒生物堿對照品，采用內標法或外標法，以定量離子對峰面積進行定量測定。定量方法可采用工作曲線法或單點校正法。采用工作曲線法時待測樣品中有毒生物堿的濃度應在工作曲線的線性范圍內。配制系列濃度的有毒生物堿血液質控樣品，按“6.1.1”進行樣品處理，按“6.2.1”條件進行測定，以有毒生物堿和內標定量離子對峰面積比（或有毒生物堿定量離子對峰面積）為縱坐標，血液中有毒生物堿濃度為橫坐標繪制工作曲線，用工作曲線對待測樣品中有毒生物堿濃度進行定量。采用單點校正法時待測樣品中有毒生物堿的濃度應在添加樣品中有毒生物堿濃度的土50%內。6.2.3.2結果計算6.2.3.2.1內標-工作曲線法在系列濃度的有毒生物堿血液質控樣品中，以有毒生物堿與內標SKF525A定量離子對的峰面積比（Y）為縱坐標、有毒生物堿質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得線性方程。根據待測樣品中有毒生物堿與內標SKF525A定量離子對峰面積比，按公式（1）計算出待測樣品中有毒生物堿的質量濃度。Yab………………式中：C——待測樣品中有毒生物堿質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；Y——待測樣品中有毒生物堿與內標峰面積比；a——線性方程的截距；b——線性方程的斜率。6.2.3.2.2內標-單點校正法根據待測樣品及添加樣品中有毒生物堿與內標SKF525A定量離子對峰面積比，按公式（2）計算出待測樣品中有毒生物堿的質量濃度。4AxAxcA,xAi………………式中：C——待測樣品中有毒生物堿質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；A——待測樣品中有毒生物堿的峰面積；A添加樣品中有毒生物堿的峰面積；Ai——待測樣品中內標的峰面積；Ai添加樣品中內標的峰面積；c——添加樣品中有毒生物堿的質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)。6.2.3.2.3外標-工作曲線法在系列濃度的有毒生物堿血液質控樣品中，以有毒生物堿定量離子對的峰面積（Y）為縱坐標、有毒生物堿質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得線性方程。根據待測樣品中有毒生物堿定量離子對峰面積，按公式（3）計算出待測樣品中有毒生物堿的質量濃度。C=Ya………………（3）b式中：C——待測樣品中有毒生物堿質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；Y——待測樣品中有毒生物堿的峰面積；a——線性方程的截距；b——線性方程的斜率。6.2.3.2.4外標-單點校正法根據待測樣品及添加樣品中有毒生物堿定量離子對峰面積，按公式（4）計算出待測樣品中有毒生物堿的質量濃度。AxcA,………………式中：C——待測樣品中有毒生物堿質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；A——待測樣品中有毒生物堿的峰面積；A添加樣品中有毒生物堿的峰面積；c——添加樣品中有毒生物堿的質量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)。6.2.3.3平行試驗待測樣品同時平行測定兩份，雙樣相對相差按公式（5）計算：RD（%）=—————x100………………（5）C式中：RD——相對相差；C1、C2——兩份待測樣品平行定量測定的質量濃度；C——兩份待測樣品平行定量測定質量濃度的平均值。6.2.4空白試驗用空白血液進行空白試驗。7結果評價7.1定性結果評價7.1.1陰性結果評價如果待測樣品中僅檢出內標SKF525A未檢出附錄A中45種有毒生物堿成分，則陰性結果可靠；如果待測樣品中未檢出內標，則陰性結果不可靠