關(guān)于細(xì)胞工程主要技術(shù)2動(dòng)物細(xì)胞工程主要技術(shù)第一章動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化（誘變）第二章細(xì)胞融合技術(shù)第三章哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)第四章哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)與移植利用雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)干細(xì)胞技術(shù)第2頁,共99頁，2024年2月25日，星期天3第一章動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（誘變）通過細(xì)胞培養(yǎng)，世界上已建立了大量細(xì)胞株，我國業(yè)已建立了上百個(gè)細(xì)胞株，為細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)做出了重大貢獻(xiàn)。正常組織的初級(jí)培養(yǎng)物，在傳代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的壽命有一定的限度，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限增殖下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而成為具有癌特性的細(xì)胞。第3頁,共99頁，2024年2月25日，星期天4建立無限細(xì)胞系的關(guān)鍵就是要千方百計(jì)地使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，即用某種因子刺激正常細(xì)胞發(fā)生突變而具有癌特性。目前，使正常培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的刺激因子主要有三大類：物理因子、化學(xué)因子和生物因子。第4頁,共99頁，2024年2月25日，星期天5（一）物理因子能使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的物理因子主要是指一些電離輻射：放射性同位素的射線：60Co、14C、131I、32P、3H……X射線紫外線照射物理致癌劑第5頁,共99頁，2024年2月25日，星期天6（二）化學(xué)因子對(duì)細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用的化學(xué)因子達(dá)數(shù)千種之多，其中有無機(jī)物，也有有機(jī)物。無機(jī)物：砷、石棉、鉻化合物、鎳化合物、鎘化合物……有機(jī)物：苯、聯(lián)苯胺、雜環(huán)烴、煤焦油、黃曲霉素(aflatoxin)、亞硝胺、煙堿(nicotine)……化學(xué)致癌劑第6頁,共99頁，2024年2月25日，星期天7（三）生物因子對(duì)細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用的生物因子為腫瘤病毒(tumorvirus)，又稱致癌病毒(oncogenicvirus)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多種病毒可引起動(dòng)物或植物發(fā)生腫瘤。腫瘤病毒中有DNA病毒，也有RNA病毒。第7頁,共99頁，2024年2月25日，星期天8Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)：一種RNA病毒，其基因組含有一個(gè)癌基因src，編碼產(chǎn)物為具有蛋白質(zhì)激酶活性的pp60src蛋白，可使許多蛋白質(zhì)磷酸化，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞癌變。pp60src蛋白是一種膜蛋白，結(jié)合在質(zhì)膜的內(nèi)表面，它可催化磷酸根轉(zhuǎn)移到一些蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使磷酸化酪氨酸在細(xì)胞中的含量提高了10倍。第8頁,共99頁，2024年2月25日，星期天9(Src蛋白,Tyr激酶)PTyr蛋白質(zhì)磷酸化細(xì)胞癌變無活性pp60srcRSV病毒中v-src基因的致癌機(jī)制圖解質(zhì)膜跨膜受體蛋白細(xì)胞外配體活性pp60src質(zhì)膜跨膜受體蛋白磷酸化酪氨酸兩種作用：一是使細(xì)胞的正常調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào),細(xì)胞增殖失去控制；二是使細(xì)胞的粘著性喪失,易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。第9頁,共99頁，2024年2月25日，星期天10雖然動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板中均可生長，但在體外利用培養(yǎng)罐進(jìn)行大量培養(yǎng)就不象培養(yǎng)細(xì)菌和酵母那樣容易，是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)難題之一。目前這一問題已經(jīng)解決，人們?cè)谖⑸锱囵B(yǎng)用的發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上研制出一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)罐，用以大量培養(yǎng)懸浮細(xì)胞（1個(gè)振動(dòng)攪拌器：可以使細(xì)胞得到充足的營養(yǎng)和氧氣）。轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)第10頁,共99頁，2024年2月25日，星期天11細(xì)胞融合(Cellfusion)又稱為細(xì)胞雜交(Cellhybridization)，現(xiàn)多統(tǒng)稱為細(xì)胞雜交，是指2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞融合成1個(gè)細(xì)胞的過程。人工的細(xì)胞融合開始于1950s，此后作為一門新興技術(shù)發(fā)展非?？?，應(yīng)用范圍也極為廣泛，不僅同種類細(xì)胞間可以融合，種間遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合。

細(xì)胞工程的發(fā)展是建立在細(xì)胞融合基礎(chǔ)上的。第二章

細(xì)胞融合技術(shù)第11頁,共99頁，2024年2月25日，星期天12細(xì)胞融合不僅可用于生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，而且在生產(chǎn)實(shí)踐上還有重要的應(yīng)用價(jià)值，如目前在單克隆抗體的制備、核質(zhì)關(guān)系、體細(xì)胞的遺傳和發(fā)育、新品種的培養(yǎng)、免疫作用、疾病的治療和性狀的改良、潛伏病毒的研究等，已取得了顯著的成績。其中最突出的就是在制備單克隆抗體方面的應(yīng)用！第12頁,共99頁，2024年2月25日，星期天13根據(jù)所用促融劑的不同，細(xì)胞融合技術(shù)主要可分為四大類：病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)電擊介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)激光介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)第13頁,共99頁，2024年2月25日，星期天14一、病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)促融劑：麻疹病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒、仙臺(tái)病毒以及其他一些副粘液科的病毒基本原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusionprotein),既可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合,又可誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞融合。

操作繁瑣；促融效果較好第14頁,共99頁，2024年2月25日，星期天15融合蛋白是副粘病毒的兩種包膜糖蛋白之一，其主要功能是引起病毒包膜與靶細(xì)胞膜或被感染的靶細(xì)胞膜之間發(fā)生融合。細(xì)胞融合過程需要另一種包膜糖蛋白――血凝素-神經(jīng)氨酸酶的協(xié)助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神經(jīng)氨酸酶共同表達(dá)才能顯示出融合細(xì)胞的活性。第15頁,共99頁，2024年2月25日，星期天16病毒增殖紫外線滅活稀釋細(xì)胞懸液細(xì)胞融合誘導(dǎo)基本操作流程篩選第16頁,共99頁，2024年2月25日，星期天17二、化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)促融劑：基本原理：一般認(rèn)為，PEG改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起,使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通,從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。操作簡便；促融效果好第17頁,共99頁，2024年2月25日，星期天18誘導(dǎo)基本操作流程A細(xì)胞融合細(xì)胞B細(xì)胞A/B細(xì)胞混合物按一定數(shù)量比例混合與細(xì)胞混合物充分混勻一定溫度、一定時(shí)間計(jì)數(shù)篩選PEG配制：加熱溶化，按體積比加入預(yù)熱至50oC的無血清培養(yǎng)基后混勻，降溫至使用溫度待用PEG配制PEG(MW1000-4000,40~60%)第18頁,共99頁，2024年2月25日，星期天19促融效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG分子量越大、濃度越高,對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大（在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的分子量1000~4000的PEG，濃度一般為40~60%）PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合效果的影響因素：1.PEG分子量與濃度:融合效果與溫度成正比（質(zhì)膜流動(dòng)性與溫度成正比），為獲得最佳融合效果,在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度（哺乳動(dòng)物細(xì)胞，一般采用38~40℃）2.PEG的pH值:pH8.0~8.2：融合效果較好3.PEG作用時(shí)間:處理時(shí)間越長，融合效果越好,但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大（一般將處理時(shí)間限制在1min之內(nèi)）4.融合溫度:第19頁,共99頁，2024年2月25日，星期天20三、電擊介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)操作簡便、快速/促融效果好/高回收率/對(duì)細(xì)胞毒性小原理：游離動(dòng)物細(xì)胞或去壁原生質(zhì)體，在電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細(xì)胞被極化成偶極子，造成細(xì)胞間相互連接成點(diǎn)接觸狀態(tài)；然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處的質(zhì)膜，此時(shí)質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時(shí)由于細(xì)胞表面的張力作用，兩個(gè)點(diǎn)接觸細(xì)胞逐步發(fā)生細(xì)胞融合。BioRad電融合儀第20頁,共99頁，2024年2月25日，星期天21動(dòng)物細(xì)胞0.6M甘露醇，0.5mMCaC12·2H2080-300V/cm,0.5-1兆赫茲,30-90秒0.5-1.5KV/cm,幅度脈寬25微秒融合細(xì)胞誘導(dǎo)基本操作流程篩選電擊液懸浮于融合小室的電極間加入至細(xì)胞排列成串電泳效應(yīng)正弦交變電場施加2-3個(gè)脈沖電場施加第21頁,共99頁，2024年2月25日，星期天22原理：貼在一起的兩個(gè)細(xì)胞，用高峰值功率密度激光對(duì)細(xì)胞接觸處的質(zhì)膜進(jìn)行輻照，質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，可產(chǎn)生微米量級(jí)的微孔，因質(zhì)膜上的微孔可逆，質(zhì)膜分子在重組過程中借助細(xì)胞連接處小孔的很高的表面曲率而處于高張力狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生融合。四、激光細(xì)胞融合技術(shù)第22頁,共99頁，2024年2月25日，星期天23激光細(xì)胞融合法與其它化學(xué)物理方法相比較具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）能選擇任意兩個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行融合；（2）因僅在兩個(gè)細(xì)胞的接觸點(diǎn)照射激光，故作用于細(xì)胞的應(yīng)力和障礙小;（3）可進(jìn)行非接觸、安全且遠(yuǎn)距離的無菌操作；（4）能適時(shí)觀察融合過程。第23頁,共99頁，2024年2月25日，星期天24第三章哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)（細(xì)胞核移植技術(shù)）第24頁,共99頁，2024年2月25日，星期天25隨著1997年2月Nature雜志報(bào)道英國Roslin研究所I.Wilmut等人創(chuàng)造的克隆羊多莉(Dolly)誕生，生物工程掀開了新的一頁。克隆(clone)一詞原意為無性繁殖系，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中早有使用，細(xì)胞克隆是指由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分裂而產(chǎn)生出的一群細(xì)胞，而動(dòng)物克隆是指由一個(gè)動(dòng)物經(jīng)無性繁殖而產(chǎn)生的遺傳性狀完全相同的后代個(gè)體。第25頁,共99頁，2024年2月25日，星期天26克隆羊“多莉”誕生后，克隆技術(shù)研究立即成為世界各國生物學(xué)家競相開展的生物學(xué)高新技術(shù)研究?？寺〖夹g(shù)之所以一經(jīng)產(chǎn)生立即引起高度重視，是因?yàn)榭寺〖夹g(shù)不但具有重要的理論意義而且具有良好的應(yīng)用前景。

第26頁,共99頁，2024年2月25日，星期天為什么要進(jìn)行動(dòng)物克隆?例：1997年，美國威斯康星州的一個(gè)奶牛場有一頭叫盧辛達(dá)的奶牛，年產(chǎn)牛奶30.8

t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高的紀(jì)錄；而一頭普通奶牛的產(chǎn)奶量年平均水平僅為3-4

t，如果能用體細(xì)胞核移植技術(shù)，克隆高產(chǎn)奶牛，就可以大大提高牛奶產(chǎn)量。第27頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共99頁，2024年2月25日，星期天29第一節(jié)哺乳動(dòng)物克隆的發(fā)展歷史同種胚胎細(xì)胞克隆同種體細(xì)胞克隆異種體細(xì)胞克隆克隆動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)歷了60余年的漫長探索，根據(jù)供體細(xì)胞核與去核卵細(xì)胞的來源可歸納為3個(gè)標(biāo)志性的發(fā)展階段。第29頁,共99頁，2024年2月25日，星期天301938年,德國科學(xué)家Spemann最早提出克隆設(shè)想。1952年,美國科學(xué)家Briggs和King將發(fā)育后期的青蛙胚胎細(xì)胞核植入青蛙卵中,沒有發(fā)育。1965年,中國科學(xué)家童第周完成了金魚核移植并獲得成功。1981年,Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎細(xì)胞第一次獲得了克隆小鼠，但其實(shí)驗(yàn)未能被重復(fù)。1984年,丹麥科學(xué)家Willadsen用胚胎細(xì)胞克隆羊獲成功。第一階段同種胚胎細(xì)胞克隆第30頁,共99頁，2024年2月25日，星期天童第周（1902-1979）童第周等(1965)將金魚囊胚細(xì)胞核移植到鳑鮍的去核卵中,獲得了少數(shù)核質(zhì)雜種(nucleo-cytoplasmichybrid,NCH)幼魚第31頁,共99頁，2024年2月25日，星期天321990年,中國科學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究所杜淼獲得了克隆兔。隨后,中國科學(xué)家利用胚胎細(xì)胞相繼克隆成了羊、豬、牛、小鼠等幾種動(dòng)物。1993年,美國的First用牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞成功地獲得了克隆牛。1997年,中國學(xué)者孟勵(lì)在美國成功獲得克隆猴。

至此,國內(nèi)外動(dòng)物克隆采用的均為胚胎細(xì)胞。第32頁,共99頁，2024年2月25日，星期天331997年，用胚胎細(xì)胞獲得的克隆猴第33頁,共99頁，2024年2月25日，星期天341964年,Gurdon以爪蟾為材料,最早進(jìn)行了體細(xì)胞核移植的嘗試,獲得了1.5％的蝌蚪。第二階段同種體細(xì)胞克隆第34頁,共99頁，2024年2月25日，星期天35Dolly的產(chǎn)生1997年,英國羅斯林研究所I.Wilmut等宣布用成年羊乳腺細(xì)胞首次獲得克隆羊“多莉”。第35頁,共99頁，2024年2月25日，星期天

實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：血清饑餓法

使細(xì)胞核與去核卵細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同步狀態(tài),以利于恢復(fù)核的全能性(重編程).第36頁,共99頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共99頁，2024年2月25日，星期天381998年，美國夏威夷大學(xué)的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘細(xì)胞核作供體，獲得了克隆再克隆小鼠。1998年，新西蘭成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上僅存的最后一頭珍稀牛。至此，同種體細(xì)胞克隆進(jìn)入成熟階段。第38頁,共99頁，2024年2月25日，星期天39克隆牛克隆獼猴克隆狗第39頁,共99頁，2024年2月25日，星期天402002年初，我國首批成年體細(xì)胞克隆牛的群體誕生第40頁,共99頁，2024年2月25日，星期天41第三階段異種體細(xì)胞克隆

瀕危物種數(shù)量日益減少，很難提供用于克隆的卵母細(xì)胞和代孕受體，促使科學(xué)家提出了異種克隆的設(shè)想：將一種動(dòng)物的體細(xì)胞核移植到另一種動(dòng)物的去核(遺傳物質(zhì))卵母細(xì)胞中，來得以實(shí)現(xiàn)克隆的技術(shù)。但此階段技術(shù)還處在實(shí)驗(yàn)探究階段，尚未完全成熟。第41頁,共99頁，2024年2月25日，星期天421998年1月，美國威斯康星大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵細(xì)胞為受體，成功克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動(dòng)物的胚胎。1998年～1999年，美國人White用珍稀動(dòng)物盤羊的體細(xì)胞核與牛卵結(jié)合，我國學(xué)者陳大元將大熊貓?bào)w細(xì)胞核與兔卵結(jié)合，均成功克隆出早期胚胎。第42頁,共99頁，2024年2月25日，星期天432000年，歐洲盤羊--奧姆布雷塔被成功克隆，科學(xué)家是為了營救目前世界上數(shù)目稀少的歐洲盤羊，避免它們從地球上滅絕消失。第43頁,共99頁，2024年2月25日，星期天442003年5月，世界上第一只克隆騾子--格姆在美國誕生第44頁,共99頁，2024年2月25日，星期天452005年8月24日，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所陳大元教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)，國際首例體細(xì)胞克隆亞洲黃羊在山東順利降生（用山羊做受體）。第45頁,共99頁，2024年2月25日，星期天46第二節(jié)哺乳動(dòng)物克隆的技術(shù)方法克隆動(dòng)物主要方法：胚胎分割胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植連續(xù)細(xì)胞核移植第46頁,共99頁，2024年2月25日，星期天47優(yōu)質(zhì)動(dòng)物體細(xì)胞的來源動(dòng)物卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)重構(gòu)胚胚胎移植克隆動(dòng)物檢測體細(xì)胞核移植法克隆動(dòng)物的基本操作流程卵母細(xì)胞核體細(xì)胞核核移植體外培養(yǎng)第47頁,共99頁，2024年2月25日，星期天481、動(dòng)物體細(xì)胞的體外培養(yǎng)G0期(細(xì)胞周期時(shí)相)常規(guī)體外培養(yǎng)降低血清使用量細(xì)胞分裂停止移核前第48頁,共99頁，2024年2月25日，星期天49卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)用M199洗3次100μl成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)液：

M199+10%FCS+10μg/mLPMSG+10μg/mLHCG5%CO2，38.5℃，飽和濕度24h或28～30h觀察卵丘擴(kuò)展情況例:小牛卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)2、卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)第49頁,共99頁，2024年2月25日，星期天50盲吸法熒光法擠壓法吸引法蔗糖法3、去核方法第50頁,共99頁，2024年2月25日，星期天51帶下注射直接胞質(zhì)內(nèi)注射法4、核注射方法透明帶應(yīng)用壓電-脈沖設(shè)備直接注射法第51頁,共99頁，2024年2月25日，星期天52常規(guī)法原核互換兩步法孤雌活化協(xié)同法化學(xué)誘導(dǎo)法5、核移植方法第52頁,共99頁，2024年2月25日，星期天53將數(shù)枚重構(gòu)胚放入100μL的胚胎培養(yǎng)液（CR1-aa）中培養(yǎng)48h后，選擇4細(xì)胞以上的胚胎移入鋪滿滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)液滴中。在120h半換液，148h加入1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半換液。6、重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞第53頁,共99頁，2024年2月25日，星期天547、胚胎移植方法假孕的同步發(fā)情的寄母輸卵管內(nèi)移植(移植1～2細(xì)胞的受精卵)子宮角移植(移植桑椹胚)第54頁,共99頁，2024年2月25日，星期天55體細(xì)胞核卵母細(xì)胞重構(gòu)胚移入同步發(fā)情的動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)體細(xì)胞克隆動(dòng)物研究路線圖體外培養(yǎng)去核胚胎移植移核第55頁,共99頁，2024年2月25日，星期天568、克隆動(dòng)物的檢測方法微衛(wèi)星圖譜法同工酶法第56頁,共99頁，2024年2月25日，星期天57克隆牛“動(dòng)動(dòng)”的微衛(wèi)星檢測結(jié)果(紅色代表標(biāo)準(zhǔn)分子量，藍(lán)色和綠色代表擴(kuò)增片段)第57頁,共99頁，2024年2月25日，星期天58受胎率低（26.2%）流產(chǎn)率高(53.8%)克隆動(dòng)物的存活率低（35.7%)常出現(xiàn)早衰現(xiàn)象存在問題第58頁,共99頁，2024年2月25日，星期天59第三節(jié)克隆動(dòng)物的衰老問題克隆羊“多莉”出現(xiàn)了早衰現(xiàn)象，其端粒長度比正常出生的羊短了20%，這與供核羊FinnDorset的6歲年齡直接相關(guān)。人類染色體端粒的熒光免疫原位雜交照片第59頁,共99頁，2024年2月25日，星期天601999年，美籍華人楊向中教授第一個(gè)報(bào)道了克隆動(dòng)物具有正常長度的端粒和遺傳年齡，得出克隆動(dòng)物不會(huì)未老先衰、克隆動(dòng)物的遺傳年齡與供體動(dòng)物年齡無關(guān)的結(jié)論。此后，這一結(jié)論被美國麻省的ATC公司在克隆牛和美國洛克菲勒大學(xué)在克隆鼠的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。第60頁,共99頁，2024年2月25日，星期天61總之，由于細(xì)胞衰老的分子機(jī)理至今仍未能研究清楚，因此有關(guān)克隆動(dòng)物的衰老問題，目前仍在爭論中，還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。端粒酶結(jié)構(gòu)的模式圖解第61頁,共99頁，2024年2月25日，星期天62第四節(jié)克隆動(dòng)物的應(yīng)用前景克隆動(dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面具有極為重要的意義，這不僅表現(xiàn)在理論研究方面，更重要的是其在應(yīng)用開發(fā)方面的實(shí)用價(jià)值。第62頁,共99頁，2024年2月25日，星期天631.克隆技術(shù)能快速培育出大量的優(yōu)良品種家畜，而用傳統(tǒng)的有性生殖方式培育動(dòng)物良種不但需要花費(fèi)很長的時(shí)間，而且優(yōu)良性狀難以在后代得到控制?？寺?dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面的意義體現(xiàn)在：2.克隆動(dòng)物的遺傳背景完全一致，因而可以避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的背景干擾，如用在藥物檢測上，所得結(jié)果將更加穩(wěn)定可靠。第63頁,共99頁，2024年2月25日，星期天643.動(dòng)物克隆技術(shù)可以用來保護(hù)瀕危動(dòng)物，用瀕危動(dòng)物的冷凍細(xì)胞隨時(shí)可以克隆出新的成體動(dòng)物，而無須耗費(fèi)大量的人力物力。第64頁,共99頁，2024年2月25日，星期天654.克隆動(dòng)物可為需要組織器官移植的病人提供所需要的組織器官。國外已經(jīng)開始了這方面的研究，例如科羅拉多大學(xué)的研究者用來源于克隆牛胎兒的多巴胺生成細(xì)胞，治療帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。第65頁,共99頁，2024年2月25日，星期天66治療性克隆示意圖第66頁,共99頁，2024年2月25日，星期天675、動(dòng)物克隆技術(shù)如果與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)結(jié)合起來將具有更大的發(fā)展?jié)摿?。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆技術(shù)有性繁殖方式需要幾代才能獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，而通過轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的方式，很快便可獲得新的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率。第67頁,共99頁，2024年2月25日，星期天68中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的科學(xué)家正在利用轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)人類母乳，并希望三年內(nèi)在超市中銷售。第68頁,共99頁，2024年2月25日，星期天692011年8月，荷蘭研究人員對(duì)山羊進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，讓羊奶含有與蜘蛛絲一樣的蛋白質(zhì)。利用這種羊奶織成的織物強(qiáng)度是鋼鐵的10倍，制造防彈皮膚。第69頁,共99頁，2024年2月25日，星期天70治療性克隆動(dòng)物模型器官移植瀕危動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器基礎(chǔ)研究遺傳育種克隆第70頁,共99頁，2024年2月25日，星期天71討論克隆人什么時(shí)候出現(xiàn)？克隆人有沒有必要？

？？？第71頁,共99頁，2024年2月25日，星期天72

一位美國專家說過，無論你相信還是懷疑，無論你支持還是反對(duì)，“克隆人的潘多拉盒子將被打開”，從那個(gè)盒子里跑出來的是驚喜也好，是噩耗也好，人類都只能接受而無法阻止。第72頁,共99頁，2024年2月25日，星期天73第四章

哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)與胚胎移植

第73頁,共99頁，2024年2月25日，星期天74第一節(jié)

胚胎培養(yǎng)早在1913年Brachet就嘗試對(duì)兔囊胚進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，可是由于對(duì)各種動(dòng)物胚胎所需的體外培養(yǎng)液配方不清楚，致使這方面工作在20世紀(jì)的上半世紀(jì)發(fā)展緩慢。1957年，美國學(xué)者Whitten找到了能使小鼠早期胚胎在體外生長發(fā)育的培養(yǎng)液配方，從而為哺乳動(dòng)物體外胚胎培養(yǎng)打開了一條通路。第74頁,共99頁，2024年2月25日，星期天75哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的發(fā)展中占有重要地位。近20多年來，世界上許多實(shí)驗(yàn)室均做了大量工作，發(fā)展迅速。第75頁,共99頁，2024年2月25日，星期天76把受精卵和不同發(fā)育時(shí)期的早期胚胎取到體外進(jìn)行培養(yǎng)，不僅是研究胚胎發(fā)育機(jī)理的重要手段，而且在培育試管嬰兒和試管動(dòng)物方面有著很大的應(yīng)用價(jià)值。哺乳動(dòng)物胚胎對(duì)發(fā)育條件要求嚴(yán)格，而且各種動(dòng)物胚胎所需的營養(yǎng)條件又有所不同，因此無法制定胚胎培養(yǎng)液的通用配方。第76頁,共99頁，2024年2月25日，星期天77體外受精不同時(shí)期胚胎的體外發(fā)育潛能一定的合成培養(yǎng)液一定的氣相條件從已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，體外胚胎培養(yǎng)有下列幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：第77頁,共99頁，2024年2月25日，星期天78成熟的卵子在試管內(nèi)同精子相遇完成受精作用的過程，稱為體外受精。獲得卵子的方法有多種，如自然排卵、激素誘發(fā)超數(shù)排卵(superovulation)、從卵巢手術(shù)取卵。人工受精率同卵子成熟度關(guān)系極大：卵巢中越接近排卵時(shí)間的卵子，受精率越高；未成熟或過熟的卵子受精率低下。一、體外受精第78頁,共99頁，2024年2月25日，星期天79人工受精所用的精子必須是獲能(capacitation)的，直接排出的精子或從附睪中取出的精子是不能授精的。所謂獲能，即精子在雌性生殖管中停留期間，發(fā)生了一定的生理、生化和形態(tài)變化，從而獲得了同卵子結(jié)合的能力的過程。在體外，利用卵巢濾泡液、血清、輸卵管液、子宮液和人工培養(yǎng)液處理，同樣可使精子獲能。第79頁,共99頁，2024年2月25日，星期天80表:丙酮酸鈉、乳酸鈉和BSA對(duì)小鼠精子體外受精力的影響培養(yǎng)液成分卵數(shù)精子穿入的卵子數(shù)（%）基礎(chǔ)培養(yǎng)液

+20毫克分子濃度乳酸鈉

+1毫克分子濃度丙酮酸鈉

+4毫克/毫升BSA*+以上三種成分18224221925833002065143289（0）（9）（30）（65）（88）人工培養(yǎng)液中的丙酮酸鈉、乳酸鈉和小牛血清白蛋白（BSA）對(duì)小鼠精子的獲能影響很大。第80頁,共99頁，2024年2月25日，星期天81受精卵和最早期胚胎較難培養(yǎng)。例如，從豬輸卵管中收集到的受精卵，90％能發(fā)育到2細(xì)胞期，但很少超過4細(xì)胞期，可是從子宮中收集到的6-8細(xì)胞期的胚胎，卻有90％的可發(fā)育到桑棋胚或囊胚。又如牛受精卵：6％可培養(yǎng)到8-12細(xì)胞期；2細(xì)胞期胚胎：則有26％可發(fā)育到8-12細(xì)胞期；8細(xì)胞期胚胎：則有51％可發(fā)育到桑椹胚。二、不同時(shí)期胚胎的體外發(fā)育潛能第81頁,共99頁，2024年2月25日，星期天82例如，1956年Whitten最早配制的培養(yǎng)液只能使8細(xì)胞期鼠胚發(fā)育成囊胚。1957年Whitten發(fā)現(xiàn)，如果把培養(yǎng)液中加入乳酸鈣，則可使2細(xì)胞胚胎發(fā)育到囊胚。1967年Whittingham和Biggers又相繼發(fā)現(xiàn)，小鼠合子在含丙酮酸/乳酸的培養(yǎng)液中很容易分裂到2-細(xì)胞期。后來他們證明，丙酮酸和草酰乙酸是第一次卵裂的單一能源，不必要含有乳酸。

第82頁,共99頁，2024年2月25日，星期天83這些差別說明：并非各時(shí)期的胚胎發(fā)育能力不同，很可能是由于各時(shí)期胚胎所需的發(fā)育條件不一樣。綜上所述，在早期胚胎培養(yǎng)時(shí)，要牢記“受精卵和最早期胚胎較難培養(yǎng)”的規(guī)律，務(wù)必要根據(jù)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同選擇特定時(shí)期的胚胎，以便成功地啟動(dòng)動(dòng)物的胚胎培養(yǎng)。第83頁,共99頁，2024年2月25日，星期天84各種動(dòng)物胚胎對(duì)培養(yǎng)液成分要求不同。目前常用的培養(yǎng)液有BMOC-3液、Whitten液、Whittingham液、Ham’sF10+20%小牛血清、SOF培養(yǎng)液、PBS+15%小牛血清、TCM-199組織培養(yǎng)液、M12培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液等。三、一定的合成培養(yǎng)液培養(yǎng)液的成分對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，不同動(dòng)物種類及不同發(fā)育時(shí)期的胚胎對(duì)培養(yǎng)液組成成分的要求不同。例如，體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物早期胚胎往往存在一個(gè)發(fā)育阻斷（blocksofdevelopment）現(xiàn)象，即從受精卵開始的體外培養(yǎng)很難一直發(fā)育到囊胚階段，而是停留在某一時(shí)期，無法向下發(fā)育。第84頁,共99頁，2024年2月25日，星期天85每種動(dòng)物都有比較固定的阻斷時(shí)期，如小鼠的2-細(xì)胞阻斷(2-cellblock)，是指小鼠體外培養(yǎng)的受精卵分裂一次成為2-細(xì)胞后，便不再繼續(xù)分裂，而如果從2-細(xì)胞晚期開始培養(yǎng)則可以發(fā)育到囊胚。其它動(dòng)物如牛的的阻斷時(shí)期為8-16細(xì)胞時(shí)期，豬為4-細(xì)胞時(shí)期。針對(duì)這一現(xiàn)象，人們首先從改變培養(yǎng)液成分入手，分析阻礙發(fā)育的原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖對(duì)小鼠胚胎發(fā)育有抑制作用，是造成2-細(xì)胞阻斷的原因。第85頁,共99頁，2024年2月25日，星期天86值得注意的是：葡萄糖雖然抑制小鼠胚胎2-細(xì)胞向4-細(xì)胞的發(fā)育，但葡萄糖對(duì)4-細(xì)胞以后的胚胎發(fā)育又是必需的。于是，Chatot(1988)對(duì)BMOC-2培養(yǎng)液進(jìn)行了改良，形成了目前受精卵體外培養(yǎng)普遍采用的CZB培養(yǎng)液，它是以谷氨酰氨代替葡萄糖，結(jié)果90%左右的受精卵發(fā)育到4-細(xì)胞時(shí)期，2-細(xì)胞阻斷被克服了。第86頁,共99頁，2024年2月25日，星期天87克服體外發(fā)育阻斷的另一方法為共同培養(yǎng)(co-culture)，是指將胚胎與輸卵管上皮細(xì)胞或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，以促進(jìn)胚胎發(fā)育。利用共培養(yǎng)技術(shù)已使豬、牛、羊等克服了體外發(fā)育阻斷現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物早期胚胎與輸卵管上皮或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng)，也是研究胚泡著床機(jī)理的良好手段。第87頁,共99頁，2024年2月25日，星期天88早期胚胎的培養(yǎng)液需配合一定的氣相條件。一般用含5％CO2的空氣或5％O2和90％N2的混合氣體調(diào)節(jié)pH值。胚胎對(duì)培養(yǎng)液pH變化很敏感，pH值超出7.2-7.4的范圍，會(huì)引起胚胎死亡。磷酸緩沖液系統(tǒng)的酸度較穩(wěn)定，氣相可用空氣。進(jìn)行體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物胚胎，一般只是著床前的早期胚胎。胚胎著床后，同母體建立了密切的物質(zhì)交換關(guān)系，對(duì)營養(yǎng)條件的要求更加復(fù)雜。因此對(duì)著床后的胚胎體外培養(yǎng)更加困難。四、一定的氣相條件第88頁,共99頁，2024年2月25日，星期天89Y.O.Hsu和L.T.Chen(1983)將受精后3.5d的鼠胚培養(yǎng)到相當(dāng)于在子宮內(nèi)正常發(fā)育的第10d胚胎，是胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間最長的。胚胎發(fā)育經(jīng)過了原腸胚、神經(jīng)胚、體節(jié)期等階段，培養(yǎng)到第10d時(shí)發(fā)育出了肢芽、眼泡以及肺、肝、胰等器官。這在哺乳動(dòng)物胚胎完全體外培養(yǎng)的道路上前進(jìn)了一大步。近年來，國內(nèi)外均有人實(shí)驗(yàn)將小鼠或兔等的胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，建立胚泡著床模型，試圖探明哺乳動(dòng)物胚泡著床的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孕酮、雌二醇等激素能促進(jìn)胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間的粘附率。第89頁,共99頁，2024年2月25日，星期天90第二節(jié)

胚胎移植

從一頭受孕母畜（供體）的生殖管道中取出受精卵或發(fā)育到一定時(shí)期的早期胚胎，移植到與供體母畜同步發(fā)情的母畜（受體）生殖管道的一定部位，繼續(xù)發(fā)長、發(fā)育，長成子畜的技術(shù)稱為胚胎移植。在人類中，供體婦女和受體婦女在排卵周期同步的情況下，轉(zhuǎn)移受精卵或早期胚胎，在受體婦女的體內(nèi)繼續(xù)孕育的技術(shù)，亦稱為胚胎移植。第90頁,共99頁，2024年2月25日，星期天911890年，英國的WalterHeape成功地進(jìn)行了家兔的胚胎移植實(shí)驗(yàn)，他把4-細(xì)胞期的安哥拉家兔胚胎移植到一只交配過的比利時(shí)野兔體內(nèi)，生下