第二章微生物多樣性Chapter2MicrobialDiversity曹慧教授南京農業大學生命科學學院生物多樣性(biodiversity)這個單詞是一個新創造的組合詞，由生物(bio)和多樣性(diversity)組合而成。biologicaldiversity由托馬斯·拉夫卓伊(ThomasLovejoy)于1980年提出，而biodiversity則由昆蟲學家威爾遜(E.O.Wilson)于1986年在國家研究委員會(NationalResearchCouncil,NRC)舉辦的首次美國生物多樣性論壇報告中提出。微生物多樣性（MicrobialDiversity）是一定區域范圍內的所有微生物種類和它們的生態環境總和。第一節什么是微生物多樣性1.1微生物多樣性概念微生物生態系統多樣性（Microbialecosystemdiversity）Speciesdiversityisanindexthatincorporatesthenumberofspeciesinanareaandalsotheirrelativeabundance.Itisgenerallyamuchmoreusefulvaluethanspeciesrichness.微生物種群多樣性（Microbialspeciesdiversity）微生物遺傳多樣性（Microbialgeneticdiversity）Geneticdiversityisalevelofbiodiversitythatreferstothetotalnumberofgeneticcharacteristicsinthegeneticmakeupofaspecies.Itisdistinguishedfromgeneticvariability,whichdescribesthetendencyofgeneticcharacteristicstovary.Ecosystemdiversityreferstothediversityofaplaceatthelevelofecosystems.Itiscontrastedwithbiodiversity,whichreferstovariationinspeciesratherthanecosystems.——FromWikipedia,thefreeencyclopedia1.2微生物多樣性的三個層次1.3微生物多樣性表現形式形態多樣性（Morphologicaldiversity）代謝多樣性（Metabolicdiversity）生態多樣性（Ecologicaldiversity）-cellshapes:rods,cocci,spirals,filaments,amorphous,star-shaped,squares,……-cellorganization:multicellularfrompairsandtetradstofilaments,sheets,rosettes,microbialmats,……-cellssize:average1to5micronsrange0.1to660microns(Thiomargarita

namibiensis,giantsulfurbacteruiminNamibiansediments)MorphologicaldiversityDimensionsofsomebacteriaChemotrophs:energyisobtainedfromchemicals

lithotrophs:inorganicchemicals(sulfur,iron,hydrogen)-autotrophs:carbonisobtainedbyfixingCO2(sulfur-reducingArchaea,methanogens)-heterotrophs:carbonisobtainedfromorganiccompounds(sulfur-reducingArchaea)

organotrophsandheterotrophs:carbonandenergyareobtainedfromorganicchemicals(heterotrophs,E.coli,pathogens)MetabolicdiversityPhototrophs:energyisobtainedfromlight

heterotrophs:

carbonisobtainedfromorganiccompounds(halophilic

Archaeaandothers)

autotrophs:carbonisobtainedbyfixingCO2(mostcyanobacteria,photosyntheticbacteria)Ecologicaldiversity-salinity:fromfreshwatertomarineandhypersalineenvironments(DeadseaandtheGreatSaltLake,halophiles)-temperature:from–12to113oC(Pyrolobus)andbeyond(121oC)-pH:from0(Thiobacillus

thiooxidans)to13(Plectonema

nostocorum)pH0is1MHCl-redoxpotential:from–450mV(methanogens)to+850mV(ironbacteria)-hydrostaticpressure:from1to1400atm(barophiles)1.4微生物多樣性影響因素（Drivefactors）營養物質環境因素生物關系Diversityarisesfromthebalancebetweenspeciationandextinctionrates.Diversitytheories“…onereasonforthehighgenomicdiversityobservedinprokaryoticcommunitiesinsoilandsedimentsisthelargepopulationsoforganismsandthecapacitytoaccumulatelargenumbersofmutations.”Howdoes“abundance”influencethisbalance?1.5微生物多樣性價值科研價值經濟價值生態價值EstimatesofbiodiversityareproblematicCultivatedCultivatedUncultivated(16SUncultivated(16SrDNArDNAclonediversity)clonediversity)傳統平板培養方法（traditionalculture-dependentmethods）群落水平生理學方法（communitylevelphysiologicalprofile，CLPP）生物標記法（Biomakers）分子微生物學方法（Molecularmicrobialdiversity）第二節微生物多樣性研究方法傳統培養分離方法是將定量樣品接種于培養基中，在一定的溫度下培養一定的時間，然后對生長的菌落計數和計算含量，并通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養分離方法采用配比簡單的營養基質和固定的培養溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少(僅占環境微生物總數的0.1%～10%)。而且，此方法繁瑣耗時，不能用于監測種群結構的動態變化。2.1傳統平板培養方法不同培養基培養的細菌種系型豐度趨勢線不同培養時間培養的細菌種系型豐度趨勢線該方法最初由美國的BIOLOG公司于1989年開發成功，最初應用于純種微生物鑒定，至今已經能夠鑒定包括細菌、酵母菌和霉菌在內的2000多種病原微生物和環境微生物。這種方法是基于微生物群落對95種不同碳源的利用度來描述群落中微生物的動態變化。其具體做法是：利用由95孔不同單一C源和1個對照孔組成的Biolog微平板系統，將土壤溶液接種到每一個微平板孔中，在一定的溫育時間內，由于不同微生物對不同單一C源利用程度和強度不一樣而發生不同生化代謝反應，最終使得每一個孔的溶液呈現出不同程度的顏色，微平板中每一孔的顏色變化可以通過酶標儀測定和記錄下來，這樣便可得到土壤微生物特有的“代謝指紋”(MetabolicFingerprint)。根據土壤微生物的代謝指紋圖譜，結合有關的計算機分析軟件和己有的菌種庫資料，可以得到某些微生物的分類鑒定，對一般細菌的鑒定可以精確到種，有的甚至精確到種以下的分類單元。2.2BIOLOG鑒定系統磷脂是構成生物細胞膜的主要成分，約占細胞干重的5%。在細胞死亡時，細胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細胞中存在，十分適合于微生物群落的動態監測。另一個重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經被作為微生物分類的依據。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。2.3脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)熒光原位雜交是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術,以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。它根據已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環境基因組中DNA分子雜交，檢測該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點是可以進行樣品的原位雜交，應用于環境中特定微生物種群鑒定、種群數量分析及其特異微生物跟蹤檢測，是目前在分子微生物生態學領域應用比較廣泛的方法之一。2.4熒光原位雜交技術（fluorescentinsituhybridization,FISH）→FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結果分析采用限制性內切酶識別雙鏈DNA分子中特異的短列，在特定的位點將DNA切開，來自不同個體基因組的含同源序列的酶切片段具有不同的長度。通過常規的電泳分離，不同長度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段長度多態性指紋圖譜，ARDRA(擴增rDNA限制性分析)和T-RFLP(末端RFLP)都是由RFLP發展而來的方法。T-RFLP法在PCR擴增進程中使用熒光標記的引物，因而PCR產物被末端標記。RFLP(ARDRA，RFLP)方法通常選擇rRNA(rDNA)的基因作為擴增對象，廣泛用于研究土壤、水體和海洋沉積物等區系微生物群落的結構和多樣性。2.5限制性片段長度多態性方法（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)環境微生物16SrDNA的文庫構建提取微生物總DNA分離、純化DNA用通用引物擴增16SrDNA酶連、轉化構建質粒文庫再以M13引物擴增插入質粒中的rDNA片段環境微生物群落結構限制性酶切分析歸納分類同樣大小的DNA序列由于含有的堿基不同，各片段的Tm值也就不同。甚至一個堿基對的不同，都會引起Tm很大的差異，DGGE或TGGE就是應用這種差異來區分不同的基因序列。這種電泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），從正極到負極梯度遞加，或是形成溫度梯度（TGGE）。電泳中的DNA到達它的變性甲酰胺濃度或溫度時，雙鏈部分解開，造成泳動速度發生變化，從而達到分離效果。2.6變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）2.7高通量測序方法2005年，在國際頂級的學術期刊《Nature》上，來美國454生命科學公司的Margulies等人發表文章介紹了一種快速簡單的測序方法：結合了DNA擴增的乳膠系統（emulsionsystem）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）為基礎的測序方法——焦磷酸測序（pyrosequencing）方法。發明者宣稱，這種測序方法比傳統的Sanger測序的方法快100倍，假如利用這種方法來進行人類基因組的測序，那么在100多天內就可以完成。在2005年年底，454公司的研究人員將這種嶄新的測序技術轉化成了商品化的儀器——GenomeSequencer20系統，并由羅氏應用科學部獨家負責在全球的銷售和技術服務等工作。GenomeSequencer20系統一經推出，就受到了國際上基因組學專家的廣泛關注，并在世界各大測序實驗室相繼成功落戶。可以說，隨著GenomeSequencer20系統的不斷推廣應用和升級，快速基因組測序的時代已經來臨，并對整個基因組學的研究將產生巨大的推動作用。1）454測序技術（GSFLX系統超高通量測序）454技術以平均序列讀長240bp遙遙領先于同系列高通量測序儀，而序列平均讀長在基因組測序拼接過程中至關重要。而且454GSFLX基因組測序儀是高性能并行計算機和服務器及配套軟件，建立信息處理平臺與數據庫，大大提高生物信息學分析能力；擁有超強的功能驗證和解析能力。2）Solexa

高通量測序技術Solexa

測序技術為新一代革新性技術分子生物學綜合技術平臺，具有高準確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優勢,該測序技術可在每一張芯片獲取1G的堿基數據，超過了傳統測序儀近百倍的工作量。Solexa

測序技術為廣大用戶提供了強大的下一代測序方法，可以同時完成傳統基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學（基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。高通量測序方法介紹①土壤微生物總DNA的提取方法直接提取法能夠破壞土壤結構，使團聚體內部的微生物釋放出來，是進行隨機和非特異性裂解的有效方法反復凍融；冰凍－煮沸；玻璃珠勻漿；液氮研磨；超聲波破碎等。土壤微生物學總DNA提取與純化B.間接提取法CoarseparticlesPellet(microbialcell)SoilcolloidSoilC.直接提取法與間接提取法比較直接提取法：優點：DNA產量高，偏嗜度低；缺點：DNA片段小，雜質高。間接提取法：優點：DNA片段大，純度高；缺點：耗時長，產量低。圖2-2間接法和