酶免檢測技術影響因素檢驗科馬燕酶免技術的分類實驗注意事項實驗中常見問題及解決方法

均相法雙抗原夾心法（測抗體）直接法雙抗體夾心法（測抗原）

酶免法間接法測抗體、抗原EIA非均相法ELISA競相法測抗體、抗原

捕獲法測IgM抗體enzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯免疫吸附測定法

酶免技術的分類雙抗體夾心法HBsAg、HBeAg雙抗原夾心法HBsAb夾心法HBcAb、HBeAb競爭法HDVIgG/M、HEVIgG/M

測IgG測IgM間接法實驗注意事項1、標本避免溶血盡量新鮮，避免細菌污染

一般5天內檢測的血清可4℃保存，否則低溫保存。

2、試劑使用前平衡至室溫配置洗液應使用去離子水或蒸餾水，保證水的新鮮3、設計實驗設計好孔位，通常陰陽對照孔各2孔、空白1孔。必要時做好標注，避免錯誤4、加樣樣品應全部加于反應孔底部，避免液體懸掛在孔壁上。加樣量準確！加下一標本時更換吸嘴5、加酶結合物一般使用滴瓶滴加滴加時應保持瓶身垂直、加液速度適中，使液滴大小均勻一致一步法時先加樣本后加酶，不可顛倒順序一般空白孔只加底物和終止液，而不能加入其它物質，尤其是酶結合物6、溫育溫度、時間要嚴格控制！最好使反應杯盡快升溫到所需溫度最好放入濕盒或水浴箱中反應板貼上即時貼

微孔板放入水浴箱后，孔內溫度上升到37℃需要一定時間。但實際工作中很少有人注意這個問題，通常是放入即計時，導致實際溫育時間不夠，弱陽性標本漏檢。解決：微孔板放水面上或濕盒中紗布浸透水，使板底部直接與37℃接觸，迅速達到溫度。7、洗板使用專用洗滌液一般洗滌4~6次若手工洗滌，前兩次洗滌應不溢出反應孔污染后面幾次洗滌應加滿所有孔干凈每次加洗滌液后應浸泡30秒再甩去洗液反應板倒扣吸水紙上拍干洗板時應注意非離子去垢劑的濃度。洗液中Tween20高于0.2%,可使包被子固相上的抗體抗原解吸附而影響測定下限。8、加底物底物A液通常是H2O2還原劑底物B液通常是TMB（3、3′、5、5′-四甲基聯苯胺）氧化劑TMB氧化后呈藍色，被2NH2SO4終止后呈黃色，450nm波長處有最大吸收峰底物B應避光保存，實驗時加完底物A、B保溫時也應避光保存。9、比色空白孔校零，讀取各孔OD值單波長or雙波長的選擇：

單波長通常是對顯色具有最大吸收的450nm或492nm雙波長酶標儀則在敏感波長450nm和非敏感波長630nm下各測定一次。使用雙波長時不必設定空白孔，否則會造成孔吸光度數為負數。若底物為OPD（鄰苯二胺），波長為492nm若底物為TMB，波長為450nm10、結果判讀不同試劑，CUTOFF值計算方法不同項目CUTOFF陽性判斷HBsAbHBeAg陰性OD*2.1>cutHBeAb（陰性OD+陽性OD）*0.5<cutHBcAb稀釋樣品陰性OD*0.5未稀釋樣品陰性OD*0.3<cut常見問題及解決辦法內源性標本因素：1、類風濕因子：一般為IgM型，可與變性IgGFc段非特異結合，因此可能與包被的IgG以及隨后加入的酶標IgG結合而產生假陽性。2、補體：包被抗體及隨后加入的酶標抗體均能激活補體而與補體C1q位點結合而產生假陽性，也可降低檢測物與固相結合而引起假陰性或測值偏低3、異嗜性抗體：人血清中含有抗齒類動物（羊、鼠等）Ig的抗體，即天然異嗜性抗體。與酶標二抗出現假陽性。4、溶菌酶：可與等電點5的低等電點蛋白強結合，雙抗體夾心法ELISA可假陽性。外源性標本因素：1、溶血：Hb中的血紅素集團有類似過氧化物的活性，溫育時吸附固相可與HRP顯色。2、細菌污染：細菌分泌的一些酶可對抗原抗體蛋白分解或直接影響酶標抗體作用，并且細菌引起標本混濁。3、標本4℃存放過久：IgG聚合成二聚體，間接法中易假陽性。建議<1周4、標本凝固不全：殘留纖維蛋白原形成的纖維蛋白塊，造成假陽性。現象可能原因解決方法顯色淡靈敏度低1、試劑盒未平衡至室溫實驗前試劑盒置于室溫平衡30分鐘以上2、水浴箱溫度不到37℃調整水浴箱溫度至37℃孵育期間不宜多開門3、孵育時間不夠校準定時鐘、準確定時4、樣品加樣量偏少校準吸液器吸嘴與移液器接合緊密吸嘴一次性使用5、酶結合物加樣量偏少瓶身應垂直滴加，保證液滴最大6、底物作用時間不夠延長至標準時間7、樣品用疊氮鈉防腐，抑制了酶活性與酶一同加入的樣品中不能用NaN3防腐8、蒸餾水被污染換用合格蒸餾水或去離子水9、洗滌液配置不當，稀釋倍數>1:20準確配置洗滌液10、試劑盒運輸時間太長，受高溫影響夏天長途運輸時，縮短時間，低溫措施11、試劑盒失效不適用失效試劑現象可能原因解決方法重復性差1、樣品數量較多、加樣時間過長重復測定標本時，盡可能使用同一移液器，裝緊吸嘴，條件、人員應盡量與上次保持一致，以排除這些因素造成的重復性差的可能性。2、加樣量不一致3、孵育時間不一致4、洗滌條件不同5、操作人員不同滿板白，陽性對照不顯色1、把終止液誤當作酶結合物、或底物使用嚴格按試劑說明書操作，加液時看準標簽，正確稀釋洗滌液，不要漏加試劑2、漏加試劑，如酶結合物、底物A、B液3、蒸餾水被污染，或盛洗滌液桶被污染，留有使酶失活的物質換用合格水盛蒸餾水的瓶子要潔凈現象可能原因解決方法滿板顯色1、底物失效、或被污染更換底物2、加好底物后在保溫時，受強光或紫外線照射顯色時避光保溫3、反應時間過長準確定時4、水浴箱溫度過高調準水浴箱溫度5、加酶量過多，50ul誤當100ul.丙肝酶稀釋時加量過多加液量、稀釋要準確6、該批樣品放置時間過長，樣品污菌樣品應新鮮，長期保存應-20℃，防止污染7、吸嘴重復使用，未洗