lb-nspa的原核表達載體的構建

奈薩綠球菌在漫長的進化過程中形成了一系列逃避人體神經系統作用的機制，嚴重阻礙了高效流行疫苗的開發。通過淋球菌Por、Pil、Opa以及LOS等外膜抗原的研究,人們發現大多數淋球菌外膜抗原都具有較大的變異性。因此,選擇免疫原性強且高度保守的淋球菌表面抗原,并輔之以高效的粘膜佐劑以提高機體抗淋球菌感染的特異性粘膜免疫水平,是淋球菌疫苗研究的一種新策略。Plante等首先克隆了奈瑟氏淋球菌的表面蛋白A(NeisseriagonorrhoeaesurfaceproteinA,NspA)基因,發現NspA抗原不但在細菌表面持續表達,而且高度保守,并具有較強免疫原性,是一個很好的淋球菌疫苗候選抗原。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位LTB(BsubunitofEscherichiacoliheat-labileenterotoxin,LTB)是繼霍亂弧菌腸毒素CTB之后發現的一種新的粘膜佐劑,它去除了大腸桿菌不耐熱腸毒素的毒性A亞單位,仍保留較好的佐劑活性。通過鼻飼、胃腸道、生殖道等途徑免疫動物,不僅可以廣泛地激活粘膜免疫系統,在粘膜表面產生高效價的特異性的sIgA,而且在血循環中可產生高效價的IgG,同時也可誘發細胞免疫應答。為了研究具有較強粘膜保護能力的高效淋球菌疫苗,我們克隆了NspA、LTB基因和融合基因LTB-NspA,構建了相應的原核表達載體并進行了鑒定,為進一步研究高效的淋球菌粘膜免疫疫苗奠定了基礎。1材料表面1.1藥品化學品檢定所淋球菌WHO-A標準株,E.coliDH5α,E.coliBL21,pET-30a由本室保存,E.coliH44815株購自中國衛生部藥品生物制品檢定所。1.2酸質粒提取和測定PCR試劑盒,限制性內切酶,T4連接酶,DNAMarker,核酸純化回收試劑盒均購自大連寶生物公司;質粒提取試劑盒,蛋白分子量Marker購自上海生物工程公司;其他試劑為進口分裝或國產分析純。2方法2.1細菌基因組dna提取分別收集淋球菌WHO-A株和E.coliH44815株的新鮮培養物,常規苯酚-氯仿法提取細菌基因組DNA,經無DNA酶的RNA酶消化后再次苯酚-氯仿法提取DNA,溶于TEbuffer貯存作為模板。2.2nspa、lvba基因表達根據GeneBank報道的NspA(gi:26324161)、LTB(gi:145830)核甘酸序列利用PrimerPremier5.0設計引物。NspA引物序列:上游(BamHⅠ):5′-GCGGAΤCCˉAΤGAAAAAAGCACΤΤGCC-3′5′?GCGGATCCˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉATGAAAAAAGCACTTGCC?3′,下游(HindⅢ):5′-CGΤΤCGAAGCΤΤˉΤCAGAAΤΤΤGACGCGCAC-3′。LTB引物序列:上游(BamHⅠ):5′-GCCGGGAΤCCˉAΤGAAΤAAAGΤAAAAΤ-3′,下游引物(HindⅢ):5′-ΤCGCAAGCΤΤˉCΤAGΤΤΤΤCCAΤACΤGAΤ-3′,引物由上海生工公司合成。NspA、LTBPCR反應體系(50μl):2.5mMdNTP4μl,25mMMgCl24μl,10×ExTaqbuffer5μl,5u/μlExTaq0.4μl,相應模板4μl,20μM的相應上下游引物各1μl,ddH2O30.6μl。PCR反應參數:94℃5min,×1;94℃30s,62℃45s(NspA)/53℃45s(LTB),72℃45s,×30;72℃10min,×1。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分析。2.3基因ntb-l-nspa的pcr擴增先用PCR法在LTB的下游和NspA的上游同時引入一段編碼6個氨基酸(Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Ser)的特殊核甘酸序列,得到LTB-Linker(LTB-L)和Linker-NspA(L-NspA),再以編碼6個氨基酸的18個堿基序列作為接頭,以純化回收的上述產物互為模板互為引物,PCR擴增得到融合基因LTB-NspA。LTB-L的引物序列為:P1(BamHⅠ):5′-GCCGGAΤCCˉAΤGGCΤCCΤCAGΤCΤAΤΤACAGAACΤAΤG-3′,Ρ2:5′-GCTCGGTACTCTCGGATCGTTTTCCATACTGATTGCC-3′;L-NspA的引物序列為:P3:5′-GATCCGAGAGTACCGAGCATGAAAAAAGCACTTGC-3′,P4(HindⅢ):5′-CGΤΤCGAAGCΤΤˉΤCAGAAΤΤΤAGCGCGCAC-3′。LTB-L、L-NspAPCR反應體系及參數同上述LTB,NspA的PCR反應。利用試劑盒純化回收產物LTB-L,L-NspA,并調兩者至等濃度。融合基因LTB-NspA的PCR體系(50μl):LTB-L、L-NspA各10μl,2.5mMdNTP5μl,25mMMgCl24μl,10×ExTaqbuffer5μl,5u/μlExTaq0.4μl,ddH2O15.6μl。PCR反應參數:94℃3min,×1;94℃30s,52℃1min,72℃1min20s,×15;72℃10min,×1;為提高效率再向體系中加入P1,P4各引物1μl,94℃3min,×1;94℃30s,62℃1min,72℃1min20s,×20;72℃10min,×1。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分析。2.4酶切產物的連接反應用試劑盒從E.coliDH5α提取質粒pET-30a,將上述所得產物NspA,LTB,LTB-NspA及pET-30a行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切。酶切體系(20μl):PCR產物或載體10μl,BamHⅠ、HindⅢ各1μl,10×Kbuffer2μl,ddH2O6μl,37℃過夜(載體37℃3h)。試劑盒純化回收上述酶切產物,與pET-30a行連接反應(20μl反應體系:目的片段5μl,載體5μl,T4ligase0.5μl,T4ligasebuffer2μl,ddH2O7.5μl);16℃反應過夜。將上述連接產物轉化入E.coliBL21。2.5陽性克隆的篩選、pcr和酶切從卡那抗性的LB平板上挑選菌落行PCR鑒定及提取質粒酶切鑒定確定陽性重組子。2.6blast結論的測定將經PCR、酶切鑒定的陽性重組子送上海生工測序,測序結果與GeneBankNspA(gi:26324161)、LTB(gi:145830)核甘酸序列作Blast分析。3結果3.1與預期l-nspa的匹配用PCR從淋球菌和大腸桿菌標準株中分別擴增出NspA、LTB基因及融合基因LTB-NspA,經在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳,可見一條與預期LTB相符大小約為372bp的清晰條帶,以及一條比LTB稍大(帶接頭的LTB,約為390bp)的清晰條帶LTB-L(見圖1);可見一條與預期NspA相符大小約為525bp的清晰條帶,以及一條比NspA稍大(帶接頭的NspA,約為540bp)的清晰條帶L-NspA(見圖2);還可見一條與預期LTB-NspA相符大小約為900bp的清晰條帶(見圖3)。3.2目的基因表達載體的篩選經酶切過的PCR產物與載體通過BamHⅠ、HindⅢ酶切位點相連接。轉化入E.coliBL21后,篩選陽性克隆,經PCR及BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR和雙酶切均能得到預期目的條帶,初步說明目的基因成功克隆至pET-30a表達載體中(見圖4)。3.3原核表達載體的構建對上海生工測序結果作Blast分析,重組表達載體中NspA序列與淋球菌WHO-A株NspA(gi:26324161)序列同源性達100%(525/525),重組表達載體中LTB序列與E.coliH44815株LTB(gi:145830)序列同源性達99.99%(374/375),其中編碼23位氨基酸Pro(CCT→CCC),而氨基酸不改變,同時分析開放讀碼框正確,說明成功構建了pET-30a-NspA,pET-30a-LTB,pET-30a-LTB-NspA的原核表達載體。4免疫蛋白的活性許多病原體通過粘膜組織感染人而致病,機體廣泛的粘膜組織共同組成的粘膜免疫系統在人體抵抗病原體感染中起著重要的第一道防線作用。淋球菌直接侵襲人體泌尿生殖道粘膜,在對抗機體的免疫作用過程中其外膜抗原產生變異以逃避機體的免疫。因此,研究開發能對淋球菌產生高效粘膜免疫應答的疫苗尤為重要。LTB是一種公認的新型粘膜佐劑,國內外許多學者將其與目的抗原混合或偶聯于目的抗原后用其免疫動物,可以激發有效的粘膜免疫應答。劉正祥等構建表達了幽門螺桿菌的融合疫苗LTB-HpaA并口服免疫小鼠,檢測顯示免疫小鼠獲得了高水平的粘膜sIgA和血清IgG抗體。Fingerut等將LTB與IDDV的VP2融合在酵母菌中表達,用融合蛋白滴眼和口服兩種方式免疫雛雞,獲得了對IDD70%～100%的免疫保護力。本實驗中經PCR、酶切和測序鑒定證實成功克隆了淋球菌高度保守的NspA和E.coliLTB,選取一段含6個氨基酸(Asp-Pro-Arg