蛋白酶激活受體2對大鼠脊髓損傷后膠質瘢痕形成早期損傷區神經膠質纖維酸性蛋白及波形蛋白表達的影響

有機質損害是中樞神經系統（cns）損傷后神經過渡的主要障礙之一。該標志是星形細胞中的絲質蛋白（gfp）和波形蛋白（iv）的強化。眾多研究提示蛋白酶激活受體2(proteaseactivatedreceptor2,PAR2)可能在脊髓損傷后膠質瘢痕形成中起關鍵作用。本研究通過PAR2特異性抑制劑、PAR2特異性激動劑及PAR2siRNA對脊髓損傷后損傷區GFAP與Vimentin蛋白表達變化的影響,探討PAR2對脊髓損傷后膠質瘢痕形成的作用,并為臨床研究抑制膠質瘢痕形成促進神經軸突再生的治療策略提供理論依據。1材料和方法1.1大鼠術后時間點篩選180只成年SpragueDawley(SD)雌性大鼠()購自重慶醫科大學實驗動物中心,并隨機分為假手術組(shamoperation組)、模型組(model組)、PAR2激動劑組(SLIGRL-NH2組)、PAR2抑制劑組(FSLLRY-NH2組)及PAR2siRNA組。每組大鼠36只,共選取術后第1d、7d及14d3個時間點,每個時間點大鼠12只,其中6只用于免疫熒光分析,另6只用于Westernblot分析。在整個實驗過程中共有19只大鼠死亡,其中手術造模時麻醉致死5只,在術后輔助排尿過程中膀胱破裂引起腹膜炎癥致死4只,術后腎衰死亡7只,不明原因死亡3只。在發現大鼠死亡時,均立即以符合實驗要求的大鼠在相同的實驗條件下再次造模并給予相應的干預,直至所有大鼠順利存活至實驗規定的時間,且所有研究組中沒有因死亡造成的大鼠數量差異。1.2硬膜下foly-nh2的注射按照UsulH的方法進行。將大鼠麻醉消毒后暴露T11-12節段脊髓硬膜,用0.88N力Yasargil動脈瘤夾(65750T,Rebstock,德國)持續夾脊髓60s,造成脊髓嚴重損傷。傷后立即打開硬脊膜并于損傷局部硬膜下分別注射FSLLRY-NH210μL(10mg∕L,PAR-3888-PI,PEPTIDESINTERNATIONAL,美國)、SLI-GRL-NH210μL(100μmol∕L,ab120176,abcam,美國)、PAR2siRNA10μL(30mmol∕L,SC-156080,SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC,美國)及生理鹽水10μL。注射完成后,于損傷處硬脊膜下腔留置導管并固定,縫合硬膜、肌肉,以含慶大霉素的生理鹽水沖洗后縫合皮膚。傷后第2d,經留置導管注入與首次同劑量的干擾劑,完成后拔出導管。假手術組大鼠只打開椎板,不進行其他操作。所有大鼠術后給予輔助排尿及常規護理。1.3聯合免疫治療將大鼠麻醉,以4﹪多聚甲醛經心臟灌注固定后,取出脊髓組織(損傷旁各0.5cm)置于4﹪多聚甲醛中后固定4h,然后放入30﹪蔗糖溶液中脫水至其沉底。脫水完成后行冰凍切片(12μm)。PBS漂洗切片(5min×3)后以0.3﹪tritonx-100浸泡5min,再次PBS漂洗(3min×3)后以正常山羊血清封閉液封閉60min(37℃),去除多余封閉液后GFAP一抗4℃孵育過夜(mouseanti-GFAP,556328,BDBiosciences,美國,1:40)。PBS漂洗切片(5min×3),相應二抗37℃孵育90min[Flur?488-ConjugatedAffiniPureGoatAnti-MouseIgG(H+L),ZF-0512,中杉金橋,1:200],經PBS漂洗(5min×3)后封片。在LEICATCSSP2激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。1.4丙烯酰胺電泳將大鼠麻醉處死后取出脊髓組織(損傷旁各0.5cm),提取脊髓組織蛋白(P0013B,碧云天)。經變性后,測定蛋白濃度(P0010,碧云天)以定量結果,取50μg總蛋白樣品經10%SDS(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺)電泳,轉至PVDF膜(IPVH00010,Millipore,美國),以western封閉液封閉90min(37℃)。加入相應一抗4℃孵育過夜(mouseanti-GFAP,556328,BDBiosciences,美國,1:500;Anti-Vimentinantibody[V9],ab8069,abcam,美國,1:1500),洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(GoatpolyclonalSecondaryAntibodytoMouseIgG1-heavychain,ab97240,abcam,美國,1:1000)37℃孵育90min,在暗室中經DAB試劑于PVDF膜上顯色,掃描各免疫印跡條帶并分析。1.5脊柱損傷后下肢運動功能的bbb評分傷后第1d、7d及14d對大鼠行后肢運動功能BBB評分,觀察各PAR2干擾劑對其后肢運動功能的影響。1.6gfap陽性染色面積率gfap陽性染色面積率gfap陽性染色面積率用Image-ProPlus6.0軟件分析計算免疫熒光圖片中GFAP的陽性染色面積及組織總面積,求得GFAP陽性染色面積率(GFAP陽性染色面積/組織總面積)。以QuantityOne-4.6.2軟件分析western條帶陽性產物IOD值,計算陽性產物和內參GAPDH的IOD值比。1.7比較方法:均數標準差以IBMSPSSStatistics19行統計分析,統計數據皆用均數±標準差(x±s)表示。多組間比較用單因素方差分析,各組數據呈正態分布并經方差齊性檢驗后,兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD)或Tamhane,sT2檢驗。檢驗水準α=0.05,雙側檢驗。2結果2.1gfap陽性染色面積率損傷后第1d,各干預組GFAP陽性染色面積率與model組相比無顯著差異(F=0.388,P=0.763)。傷后第7d及第14d,各實驗組之間比較有顯著差異(7d,F=76.250,P<0.01;14d,F=141.243,P<0.01)。兩兩比較顯示,FSLLRY-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)的GFAP陽性染色面積率均顯著低于model組;SLIGRL-NH2組(7d,P<0.01;14d,P=0.019)GFAP陽性染色面積率顯著高于model組;而在FSLLRY-NH2組與siRNA組之間比較,GFAP陽性染色面積率未見明顯差異(7d,P=0.289;14d,P=0.940)(圖1,表1)。2.2gfap表達損傷后第1d,各干預組GFAP的表達與model組相比無顯著差異(F=0.085,P=0.968)。傷后第7d及第14d,各組之間GFAP(7d,F=85.858,P<0.01;14d,F=163.143,P<0.01)的表達有顯著差異。進一步兩兩比較顯示FSLLRY-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)GFAP的表達低于model組;而SLI-GRL-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)GFAP的表達高于model組;而在FSLLRY-NH2組與siRNA組之間比較,GFAP的表達未見明顯差異(7d,P=0.598;14d,P=0.713)(圖2,表2)。2.3fluslr-nh2對sirnin蛋白表達的影響損傷后第1d,各干預組Vimentin蛋白的表達與model組相比無顯著差異(F=0.423,P=0.739)。傷后第7d及第14d,各組間Vimentin蛋白(7d,F=66.040,P<0.01;14d,F=113.653,P<0.01)的表達有顯著差異。進一步兩兩比較顯示FSLL-RY-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)Vimentin蛋白的表達低于model組;而SLIGRL-NH2組(7d,P=0.001;14d,P<0.01)Vimentin蛋白的表達高于model組;而在FSLLRY-NH2組與siRNA組之間比較,Vimentin蛋白的表達未見明顯差異(7d,P=0.900;14d,P=0.822)(圖3,表3)。2.4運動功能bcb評分脊髓損傷后第1d及第7d(7d,F=2.626,P=0.079),各干預組大鼠后肢運動功能BBB評分無顯著差異。而在傷后第14d,各實驗組大鼠后肢運動功能BBB評分有顯著差異(F=773.889,P=0.000)。進一步兩兩比較顯示FSLLRY-NH2組(P=0.003)及siRNA組(P=0.006)BBB評分高于model組;而SLIGRL-NH2組(P=0.030)BBB評分則低于模型組(表4)。FSLLRY-NH2組與siRNA組比較無顯著差異(P=1.000)。3par2對髓傷痛大鼠骨髓損傷后gfap和vintin表達的影響脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是一種常見的高致殘性傷害,造成了巨大的社會經濟負擔,然而針對SCI后損傷機制和治療措施的研究至今仍未獲得較為滿意的結果。研究發現,CNS損傷后發生反應性膠質增生,初期可能有利于維持損傷局部微環境的穩定,但持續的膠質增生將導致膠質瘢痕形成,并成為損傷后軸突再生的主要障礙,這一點在SCI修復中表現得尤為突出。膠質瘢痕最主要的構成成份為星形膠質細胞,其在CNS損傷后反應性膠質增生的過程中大量增殖,并明顯上調表達其細胞骨架的兩種中間絲成分——GFAP和Vimentin,成為膠質瘢痕形成的標志。在我們前期的研究中亦發現,同時抑制中間絲GFAP和Vimentin的表達后,膠質瘢痕的形成減弱,神經芽生增強。該研究證實了GFAP、Vimentin在膠質瘢痕形成中的重要意義,同時亦初步證實抑制膠質瘢痕對神經再生的促進作用。然而作為膠質瘢痕基本構成成分,GFAP、Vimentin表達的分子調節機制至今仍不清楚。PAR2為PARs(G蛋白偶聯受體家族)家族成員,其廣泛地分布于CNS中的神經元、小膠質細胞及星形膠質細胞,能被胰蛋白酶及肥大細胞類胰蛋白酶所激活,并在CNS炎癥反應、缺血及神經退行性改變等病理過程中發揮著重要作用。眾多研究提示PAR2可能在脊髓損傷后炎癥反應介導的膠質瘢痕形成中發揮了重要作用,但目前尚缺乏相關研究證實。對此,本實驗深入研究了PAR2對脊髓損傷早期損傷區GFAP和Vimentin表達的影響。結果表明,在脊髓損傷后的第7d及14d,FSLLRY-NH2組及PAR2siRNA組大鼠GFAP及Vimentin蛋白的表達低于模型組,而SLIGRL-NH2組高于模型組,差異皆有統計學意義(P<0.05)。在脊髓損傷后第14d的BBB評分表明FSLLRY-NH2組及PAR2siRNA組大鼠的BBB評分高于模型組,而SLI-GRL-NH2組大鼠的評分則低于模型組,差異皆有統計學意義(P<0.05)。然而,值得注意的是各干預組中BBB評分在傷后第7d與模型組相比未見顯著差異(P>0.05),但仔細分析數據后發現FSLLRY-NH2組及PAR2siRNA組大鼠的BBB評分絕對值仍高于模型組,而SLIGRL-NH2組大鼠的BBB評分絕對值仍低于模型組。出現此種情況的可能原因為:本實驗中造成的脊髓損傷重,傷后的運動功能恢復緩慢,且干預PAR2對脊髓損傷后功能恢復的影響可能具有時間累積效應,以致傷后第7d還不足以表現出統計學差異。但是,本實驗也發現傷后第7d各干預組GFAP及Vimentin蛋白的表達與模型組相比具有顯著差異(P<0.05),BBB評分結果似乎與此結果不一致,可能的原因為PAR2對脊髓損傷后功能恢復的作用是通過影響GFAP及Vimentin蛋白的表達進而影響神經軸突生長來完成,脊髓損傷后的功能恢復與GFAP及Vimentin蛋白的表達相比具有時間滯后性,因此在該兩種蛋白表達表現出統計差異時,BBB評分卻未見統計學差異。這些結果表明在大鼠脊髓損傷早期激動PAR2能促進大鼠脊髓損傷后膠質瘢痕形成早期損傷區GFAP與Vimentin的表達,而抑制PAR2則可抑制該兩種蛋白的表達,并改善脊髓損傷后膠質瘢痕形成早期的后肢運動功能。從而初步證實了PAR2參與脊髓損傷后炎癥介導的膠質瘢痕形成過程,PAR2可能是抑制損傷后膠質瘢痕形成的治療靶點。然而,PAR2影響脊髓損傷后GFAP及Vimentin表達的具體機制是什么,目前尚未有直接研究證實,但近年的研究卻提供了一些間接的線索。研究發現脊髓損傷后損傷局部的炎癥細胞將釋放大量前炎癥因子,這些前炎癥因子不僅可以激活星形膠質細胞中的PAR2,還可促進PAR2在該細胞中的表達上調。ParkGH等在細胞實驗中發現激活的PAR2能激活cJun氨基端激酶(c-JunN-terminalKinase,JNK),并觀察到星膠細胞形態變化;同時,GadeaA等在細胞研究中發現JNK激活后,GFAP及Vimentin表達增加、星膠細胞增生及反應性膠質化形成,而BernardiA在研究中發現抑制JNK激活后,GFAP表達下降。因此我們推