植物乳桿菌發酵培養基的優化

蘑菇是一種陽性菌，可以通過蒸發來促進碳氫化合物，主要代謝為亞硝酸鹽。它廣泛分布于自然界，種類繁多。這是動物胃的主要菌群。它具有調節動物胃菌群的平衡，改善腸道環境，改善酶和阻力，從而在食品、牲畜和醫藥等領域得到廣泛應用。隨著分子生物學研究技術的日益成熟,應用這類技術對乳酸菌的研究更加深入,這些研究加深了人們對于乳酸菌益生作用的認識,乳酸菌成為微生物學家和營養專家研究的熱點。本文主要是通過對植物乳桿菌的培養基進行優化,從而使植物乳桿菌的菌體生物量達到最大,為乳酸菌的高密度發酵和工業化生產提供參考。1材料和方法1.1該菌株的來源植物乳桿菌由中國微生物保藏中心提供。1.2dna種子培養基:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖5.0g、吐溫801.0ml、檸檬酸氫二銨2.0g、無水乙酸鈉5.0g、K2HPO42.0g、MnSO4·H2O0.05g、MgSO4·7H2O0.2g、蒸餾水1.0L,pH值6.8。MRS固體培養基:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖20.0g、無水乙酸鈉5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、Tween801.0ml、K2HPO42.0g、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·H2O0.05g、CaCO320.0g、瓊脂18.0g、蒸餾水1.0L,pH值6.8。MRS液體培養基:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐溫801.0ml、檸檬酸氫二銨2.0g、無水乙酸鈉5.0g、K2HPO42.0g、MnSO4·H2O0.05g、MgSO4·7H2O0.2g、蒸餾水1.0L,pH值6.8。1.3培養基的制備取斜面菌種一環,接入MRS液體培養基中,37℃培養24h,活化兩代。將活化后的乳酸菌,接入400mlMRS液體培養基中,接種量為2%。將接入菌體的液體培養基搖勻后分裝于10mlEP管中,每管5ml,置于37℃的培養箱中靜置培養。每隔2h取三支EP管置4℃冰箱保存。待EP管全部取完后,用722分光光度計在光程為1cm、波長為600nm測量吸光度值,以同一批次滅菌而未接入菌種的MRS液體培養基為參比,繪制菌體生長曲線。1.4干預培養基成分1.4.1碳源od和酸度計ph值的測定,采用分光光度計計算nm選取葡萄糖、乳糖、蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉為碳源,仍以2%的添加量替代MRS培養基中的碳源,培養16h后,用722分光光度計在600nm的條件下測定OD值,用酸度計測定pH值。將最佳碳源分別以1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%的添加量加入MRS培養基中,37℃靜置培養16h,測定OD值。1.4.2氮源添加量的確定選取硫酸銨、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨和牛肉膏組合(11)為氮源,按照MRS培養基中氮的含量和以上每種物質中所含的總氮量分別折算氮源的添加量。37℃培養16h,測定OD值。將最佳氮源分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的添加量加入MRS培養基中,37℃靜置培養16h,測定OD值。1.4.3復配因子對乳酸菌繁殖速率的影響將MRS中的無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、MnSO4·H2O0.05g、MgSO4·7H2O和吐溫80分別單一加入培養基中,通過測定OD值,得出各種無機鹽及刺激因子對乳酸菌繁殖速率的相關性。依據各種無機鹽、刺激因子及緩沖鹽對乳酸菌繁殖快慢的影響,對各種物質的添加量進行篩選。1.4.4正交試驗考慮到各個因素之間的互作作用,選取葡萄糖、蛋白胨和MnSO4·H2O三個因素為主要因素,進行L9(33)正交試驗設計。1.5統計分析用Excel將不同培養基成分對植物乳桿菌OD值和pH值的影響進行整理,通過SPSS17.0進行差異顯著性分析。2結果與分析2.1培養過程中ph值的變化通過生長曲線我們可以看出,隨著培養時間的增加,植物乳桿菌的生物量在迅速增長,在4h進入對數期,到達16h進入穩定期,24h以后OD值略有下降,可能是由于一部分細菌發生菌體自溶。pH值的變化和植物乳桿菌的生物量變化是相符合的,由于植物乳桿菌發酵過程中產生乳酸,所以,隨著培養時間的增加,pH值急劇下降,當培養到16h,pH值下降幅度減小,逐漸趨于穩定。由于發酵產物中積累了大量的乳酸抑制了乳酸菌的繁殖,所以pH值的下降幅度會減小。2.2最佳碳源的確定如圖2所示,植物乳桿菌的最佳碳源為葡萄糖,其次為蔗糖,再次為糖蜜,淀粉不能被植物乳桿菌有效利用,因為淀粉為多糖,乳酸菌在利用的過程中需要水解成單糖后才可以吸收利用。乳酸菌本身缺乏分泌分解淀粉的酶,所以對淀粉的利用效果最差;而葡萄糖作為碳源對植物乳桿菌的生長促進作用明顯,而淀粉不能有效促進植物乳桿菌的生長。葡萄糖為速效利用碳源,屬于單糖,可以被乳酸菌直接利用,迅速提高菌體的生物量。2.3od值的測定隨著葡萄糖添加量的增加,OD值逐漸增大,當添加量達到3.0%,OD值達到最大;再增加葡萄糖的量,OD值又逐漸減小,但降低的幅度不明顯。葡萄糖的添加量在3.0%處出現拐點,所以葡萄糖的最佳添加量為3.0%。2.4無機氮源的利用由圖4中可以看出,牛肉膏和蛋白胨為有機氮源,能夠有效促進植物乳桿菌的生長,而植物乳桿菌對于無機氮源的利用效果較差。由于乳酸菌合成蛋白和分解蛋白的能力都比較差,不易利用無機氮源,而有機氮源中含有豐富的氨基酸比較容易被吸收,所以能有效提高植物乳桿菌的菌體生物量。單獨使用蛋白胨與混合牛肉膏使用對植物乳桿菌的效果一樣,考慮到成本問題,選用蛋白胨為植物乳桿菌的氮源。2.5測定od值選擇蛋白胨的添加量為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%,培養16h后,測定OD值。如圖5顯示,隨著蛋白胨添加量的增加,植物乳桿菌的OD值在不斷增加,在3.0%處出現拐點,所以蛋白胨的最適添加量為3.0%。2.6試驗設計和分組在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的培養基中依次單一加入無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4和吐溫80進行試驗,以不加以上的無機鹽、刺激因子和緩沖鹽為對照組。結果表明,添加無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、MnSO4·H2O和吐溫80對乳酸菌的增殖有促進作用,其中MnSO4·H2O對植物乳桿菌菌的增殖效果最為明顯,其次為無水乙酸鈉,而硫酸鎂和磷酸氫二鉀對植物乳桿菌的促進作用不大。2.6.1硫酸錳對照的選擇在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的培養基中,依次加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30g/l的硫酸錳,以不加硫酸錳作為對照。結果表明,在培養基中添加0.05g/l的硫酸錳對植物乳桿菌的促進作用最強,所以硫酸錳的添加量為0.05g/l。2.6.2無水乙酸鈉的添加量在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、加入硫酸錳0.05g/l的培養基中,依次加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的無水乙酸鈉,不添加無水乙酸鈉為對照。結果表明,1.4%的無水乙酸鈉對植物乳桿菌的促進作用最為明顯。2.6.3不同濃度的植物乳桿菌總糖和檸檬酸氫二銨總糖對2.5%檸檬酸氫二銨菌體10.5%的影響與篩選硫酸錳和無水乙酸鈉同樣的道理篩選檸檬酸氫二銨。結果表明:隨著檸檬酸氫二銨濃度增加,植物乳桿菌的濃度隨之增加,在0.5%時達到最大,繼續增加檸檬酸氫二銨濃度,菌體濃度逐漸下降。可能的原因是檸檬酸氫二銨對植物乳桿菌的糖酵解途徑的關鍵酶——磷酸果糖激酶具有調節作用,檸檬酸對磷酸果糖激酶具有抑制作用,而NH4+可以解除檸檬酸的抑制作用。2.6.4吐溫80對代謝產物的活性吐溫80作為一種刺激物質,對植物乳桿菌的增殖作用不是很大,但是在培養基中添加吐溫80對代謝產物中產生特定的代謝產物有一定作用,由圖10可知,吐溫80的最佳添加量為0.40%。2.7酵母浸粉添加量對植物乳桿菌生長的影響酵母浸粉中含有豐富的維生素和生長因子,在培養基中添加少量酵母粉對細菌的繁殖有促進作用,由圖11可知,添加1.0%的酵母浸粉對植物乳桿菌的促進作用最好,在此添加量出現拐點。2.8培養基的確定正交試驗設計見表1,正交試驗結果見表2。由正交試驗結果可知,從R值可以看出,影響植物乳桿菌OD值的主次順序為A>C>B,因此,植物乳桿菌發酵培養基的最優培養基組合為A2B2C3,即葡萄糖的添加量為3.0%、蛋白胨添加量為3.0%、硫酸錳的添加量為0.07g/l。從R值可以看出,培養基中的葡萄糖對OD值影響最大,綜合考慮發酵條件的互作效應,植物乳桿菌發酵培養基的最優組合為葡萄糖3.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1%、無水乙酸鈉1.4%、檸檬酸氫二銨0.5%、MnSO4·H2O0.07g/l、MgSO4·7H2O0.2%、K2HPO40.2%、吐溫800.4%。在此條件下進行驗證試驗,OD值提高到17.258,大約是優化前的2倍。3討論3.1植物乳桿菌最佳碳源的確定碳源是微生物繁殖過程中的主要物質之一,是構成細胞物質的基礎,為微生物繁殖過程中提供大量的能源。如果碳源合適則乳酸菌吸收和利用碳源比較容易,從而節省了大量的能量,有利于菌體生長;反之,乳酸菌吸收和利用碳源時要消耗大量的能量,不利于乳酸菌的增殖。徐洪偉等研究了不同碳源、氮源對乳酸桿菌小分子肽產量及抑菌效果的影響,結果表明葡萄糖為碳源的發酵液的生物量最大。梁璋成等對植物乳桿菌R23進行了培養基的優化,結果指出植物乳桿菌最佳碳源為葡萄糖。Lovijesteijn等研究指出,德氏保加利亞乳桿菌NCFB2772以葡萄糖為碳源比以果糖為碳源時產胞外多糖的量提高2倍。本試驗選用葡糖糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、淀粉等作為碳源,結果表明,3%的葡萄糖對植物乳桿菌的增殖作用最好,結果與前人研究相一致。葡萄糖是細胞的供能物質和主要的碳源物質,不同碳源相比較,葡萄糖為單糖而且是速效利用碳源,而淀粉為多糖需要分解為單糖或二糖才能被利用。當然,不同種屬的乳酸菌對碳源的種類要求不同,不同的研究需要的代謝產物不同而需選擇不同的碳源。3.2生物活性培養基用于培養乳酸菌的氮源有很多,包括有機氮源和無機氮源。氮是微生物生長發育過程中組成核酸和蛋白質的重要元素,對微生物的生長發育有著重要作用。實驗室常用于培養乳酸菌的培養基有MRS、CM和M17,而這三種培養基的共同特點是氮源由多種有機氮源混合提供。從試驗結果看出,植物乳桿菌對無機氮源的利用效果差,因為植物乳桿菌對氮源要求比較苛刻,必須吸收利用多種有機氮源中的氨基酸和生長因子才能有效促進植物乳桿菌的生長,所以最終選擇3.0%的蛋白胨提供氮源。3.3其他酶激活劑的使用可增加乳酸菌生長的影響無機鹽也是細菌生長不可缺少的物質,無機鹽的主要作用是維持菌體的滲透壓,另一方面一些離子對細菌體內的酶有激活作用。乳酸菌在代謝過程中產生乳酸使pH值下降,故培養基中需要加入一些緩沖鹽來調節pH值,維持滲透壓,從而使乳酸菌更好地生長。梁璋成等報道在培養基中引入0.05g/lMnSO4菌量比無錳培養基高2倍左右,可能是因為Mn2+是葡萄糖激酶、醛縮酶、變位酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸激酶等主要酶的激活劑。陳秀珠等的研究顯示,Mn2+對Nisin的產生有促進作用,Cu2+則有強烈的抑制作用;Mg2+可增加細菌素PediocinAcH的產量。本試驗對多種無機鹽進行篩選,結果顯示,硫酸錳和無水乙酸鈉對植物乳桿菌的生長促進作用較大,此結果與梁璋成報道相一致。而磷酸氫二鉀、硫酸鎂和檸檬酸氫二銨對植物乳桿菌的生長促進作用不明顯,但是考慮到Mg2+和磷是很多酶的激活劑,對產生某種特定的代謝產物起一定的作用,所以在培養基中加入了少量的Mg2+和P。3.4tween80對乳酸球形sm526的影響Garver等研究發現,在MRS培養基中添加Tween80對細菌的生長無明顯影響,但添加Tween80乳酸菌代謝物中會產生彎曲乳桿菌素(CurvaticinFS47)。在培養基中添加1%的Tween80可提高乳酸乳球菌乳脂亞種J46的細菌素產量,但是增加到2%時,對其產量并無影響。莊緒亮等研究了不同發酵條件下Tween80對乳酸鏈球菌SM526產Nisin的影響,結果表明,在pH值為7.0發酵條件下,Tween80對乳酸鏈球菌SM526產Nisin都有一定