基于非培養技術構建殺線蟲蛋白酶基因宏基因組fosmid克隆pro12

土壤環境中存在著巨大的微生物遺傳資源。然而,環境樣品中,超過99%的微生物不能用純培養的方法獲得。因而,多數的微生物不能夠被描述,阻礙了對微生物群體結構和生態功能的研究,以及微生物基因資源的挖掘和利用。隨著分子生物學的發展,PCR技術的應用,通過構建基因克隆文庫和質粒文庫,一些有用的基因及所編碼的代謝產物被篩選出來,然而,這些基因是基于已知序列信息的基礎上的,事實上,大多數的微生物基因序列信息是未知的。因此,可供挖掘利用的微生物功能基因極其有限,為了克服這些局限,一項新的技術,宏基因組技術,在20世紀90年代后期開始發展起來。宏基因組是對整個環境樣品的微生物群體的基因組分析。這一概念最初是由Handelsman提出。根結線蟲(Meloidogynespp.)是植物根系專性內寄生物。在世界范圍內,每年導致1000億美元的損失。近年來,隨著我國溫室蔬菜種植面積的擴大,蔬菜根結線蟲病的發生逐年加重,嚴重地產量損失達30%-50%,成為溫室蔬菜生產的一大障礙。目前,微生物蛋白酶被認為是線蟲致病的毒力因子。研究表明微生物蛋白酶通過降解宿主外層保護屏障,侵染宿主。然而,之前的研究都是基于可培養的微生物,對不可純培養的微生物研究較少?；诖?我們直接從溫室線蟲發生地黃瓜根圍土壤取樣,構建宏基因組Fosmid文庫,通過對文庫進行殺線蟲蛋白酶基因篩選,篩選到1個殺線蟲蛋白酶基因,并對基因結構進行了初步分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1方法與試劑超低溫離心機(Sigma,Type:3k15),PCR儀(BIO-RAD,ALS-1296),凝膠成像儀(BIO-RAD,76S/06413),普通水平電泳儀(BIO-RAD,PAC3000),顯微成像儀(OLYMPUS,SZX12);文庫構建用的Fosmid試劑盒:CopyControlTMHTPFosmidLibraryProductionKit),FosmidDNA提取用試劑盒:FosmidMAXTMDNAPurificationKit,均購自美國EPI公司(Epicentre,USA);引物由上海生工生物技術有限公司合成。1.1.2樣品的采集和預處理土樣于2008年3月采集自海淀區中國農業科學院蔬菜花卉研究所試驗農場黃瓜種植地。種植黃瓜年限10年以上。采樣地選擇10個種植黃瓜的地塊。土壤樣品采用五點采樣法,用土壤采樣器采集5個黃瓜根圍(采集直徑10cm)的土壤樣品,采集深度為0-15cm,混合后用密封袋帶回,土樣用10mesh(2mm)篩網過篩,去除小顆粒的石頭和殘存的植物根系,存放于-20℃冰箱中。土壤性質見表1。1.1.3引用：表2顯示了細菌、放線菌、古菌和真菌的一般引用1.2nywelld-nzoslo,norw-1,10參考Bertrand等有所改進。含微生物細胞的沉淀用10mL0.8%NaCl重懸后,補上10mL的PVPP,渦旋混勻,10000×g,4℃離心10min后棄上清,重復3-5次,至上清呈淡褐色,沉淀用10mL0.8%NaCl重懸。將10mLNycodenz(Axis-Shield,Oslo,Norway;8gNycodenz溶于10mL滅菌水)加入懸液底部,11000×g,4℃離心30min。小心收集在Nycodenz-土壤混合顆粒和上層水層分界面上的白色細胞層,重懸后在10000×g4℃離心20min去除Nycodenz溶液。緊接著用蛋白酶K—溶菌酶—SDS法提取土壤DNA,用100μLTE溶解,1%瓊脂糖電泳檢測,-20℃保存。1.3fosmidfolmid文檔的構建1.3.1dna電泳檢測Nycodenz密度梯度離心法提取的粗DNA經低熔點瓊脂糖電泳(4℃,25V,8h),溶膠酶法回收主帶,脈沖場電泳檢測DNA分子量大小(0.1-40s,6V/cm,16h)。1.3.2低熔點瓊脂糖脈沖電泳按照Epicenter公司CopyControlTMHTPFosmidLibraryProductionKit的使用說明對DNA片段進行末端補平,然后再進行一次低熔點瓊脂糖脈沖電泳(0.1-40s,6V/cm,16h),切取25-48kb之間的條帶,溶膠酶法回收DNA,連接,包裝,轉導入EPI300宿主細胞中,涂到含12.5mg/L氯霉素的LB平板上。1.3.3菌株的培養用無菌牙簽將平板上的單菌落挑至96孔板,每個菌落一個孔,每孔加入150μL含12.5mg/L氯霉素的LB液體培養基,用膜封口,37℃溫箱中培養過夜。1.3.4質粒提取和克隆穩定性檢測插入片段大小檢測:隨機挑取13個克隆,根據Fosmid文庫構建試劑盒的說明書對其進行誘導培養,使其獲得高拷貝質粒,按照FosmidMAXTMDNAPurificationKit使用說明提取質粒DNA,然后用NotI酶切,脈沖電泳檢測插入片段大小。克隆穩定性檢測:隨機挑取5個克隆,分別接種于1mL含氯霉素的LB液體培養基中繼代培養6d,分別提取第0代(第1天)和第100代(第6天)細菌培養物中的質粒DNA,EcoRⅠ酶切后,電泳檢測。文庫中包含的微生物物種多樣性檢測:從文庫中隨機抽取138個克隆進行單末端測序,然后進行BLAST比對,檢測比對結果的重復度。1.4酶基因的篩選1.4.1級池區每個96孔板包含8行,12列。構建二級池時,將保存好的96孔板中8行轉接到新的96孔板中的同一行,12列轉接到另外一個新96孔板中同一列,并補上150μL含12.5mg/L氯霉素的LB液體培養基,37℃培養過夜。這樣就形成了42個8合1板和27個12合1板。即二級池。將8合1板中同一行的克隆保存到一塊新的96孔板中的同一個孔(方法同保存8合1或12合1),這樣就形成了4塊96合1克隆板,即超級池。1.4.2蛋白酶基因檢測將Fosmid克隆接種于LB固體培養基(含1%脫脂奶,12.5mg/L氯霉素)上,37℃,培養48h,通過觀察菌落周圍是否有透明圈來確定該克隆是否含蛋白酶基因。1.5lb固體培養基提取FosmidDNA,經EcoRⅠ和SPhⅠ雙酶切后,膠回收1.5—5kb大小的片段,連接到用相應的酶酶切后的pUC19載體上,轉化(用E.coliDH5α)后,涂板于LB固體培養基(含50mg/L氨芐青霉素)上,37℃,12h后,挑取盡量多的亞克隆,37℃,搖菌培養12h,將亞克隆轉接到LB固體培養基(含1%脫脂奶,50mg/L氨芐青霉素)上,37℃,16h后,將周圍產生透明圈的亞克隆挑出,37℃,搖菌培養12h,加上終濃度為15%的甘油,-20℃冰箱保菌備用。1.6線蟲處理與生物測定以根結線蟲(Meloidogynespp.)為靶標,按照Huang等的方法稍作修改,進行殺線蟲生物測定試驗。將保存好的亞克隆菌液從-20℃冰箱中取出,待其融化后,取1μL,接種于裝有50mL液體LB培養基的100mL三角瓶中,28℃,240r/min,培養4d后,取出,4℃,8000×g離心10min,收集上清。上清液分成兩部分,一部分直接處理線蟲,一部分高溫熱處理(100℃,25min)后作用于線蟲。生物測定試驗在12孔平底細胞培養板中進行,每孔2mL處理液,200-300頭線蟲,在顯微成像儀下觀察死亡的線蟲數。試驗5次處理(陽性對照阿維菌素(Abamectin),發酵上清液,熱處理發酵上清液,陰性E.coli對照和LB培養基對照),每處理至少3次重復。1.7數據庫的構建提取克隆espro124a5質粒,送北京諾賽諾賽基因組研究中心測序。序列分析在生物學軟件DNAman和DNAstar中進行。亞克隆中包含的基因數和核酸序列運用在線分析頁面(/berry.phtml?topic=fgenesb&group=help&subgroup=gfindb)進行預測其是否含有獨立的啟動子,同時,進入網絡數據庫(http://merops.sanger.ac.uk),對蛋白酶進行分類和鑒定。2結果和分析2.1原位裂解法結合PVPP預處理和Nycodenz密度梯度離心法提取的微生物基因組DNA純度高,跟直接原位裂解法提土壤DNA相比較,能有效去除土壤腐殖酸,有機質等。并分別以細菌、放線菌、古菌和真菌通用引物(表2)進行PCR擴增,均擴增出各自的rDNA目的條帶說明純度上能夠達到構建基因組文庫的要求。2.2fosmid文檔的構建和資源分析2.2.1土壤微生物dna結構間接法提取純化后的DNA在23-97kb之間有明顯分布,而Fosmid質粒對插入片段大小的要求一般為40kb左右,所以所提DNA無需機械打斷即符合建庫要求。此外,相比于單一物種的基因組DNA,土壤微生物DNA主帶并不明顯集中于某一長度區域,而是分布在較大的范圍內,這可能有兩方面的原因:其一,不同物種的基因組DNA大小不一;其二,提取過程中機械損傷造成DNA斷裂。2.2.2土壤微生物aca的缺失產物,多表現在土壤微生物的t用NotⅠ進行酶切發現,所有克隆在6.5-9.4kb之間有一條8.2kb的載體條帶,而插入片段呈大小不同的多個片段,這可能是土壤微生物DNA上的NotⅠ酶切位點較多的原因。文庫包含31008個克隆,根據所使用的pCC2FOS質粒插入片段大小為40kb左右,估計該文庫所覆蓋的基因組大小超過1Gb。2.2.3克林波特穩定性試驗第100代酶切圖譜與第0代的無任何明顯差異,沒有發現插入片段的丟失或重排,說明所構建的Fosmid文庫是穩定的。2.2.4微生物物種數量138個隨機末端測序結果中,有6個分別比對上黃單胞菌、新月柄桿菌、漢堡硝化桿菌、Parvibaculumlavamentivorans、茄科雷爾氏菌和苜蓿中華根瘤菌,4個比對上熒光假單胞桿菌。共10個比對上了同源序列,占7.25%。無同源序列的克隆共128個,占到92.75%。這表明該文庫富含大量未知微生物物種。其次,10個比對上同源序列的都是細菌序列,這可能是有兩方面的原因,其一,細菌是該環境樣品的優勢菌群,其物種豐度遠遠高于古菌、真菌以及其他微生物;其二,間接提取DNA的方法得到細菌比例更大一些。此外,由測序結果分析該文庫的空載率僅為1.2%,隨機性為1.000。部分BLAST比對結果見表3。2.3pro12周圍透明圈以脫脂奶為底物,將超級池和二級池中的Fosmid克隆轉接到LB脫脂奶板上,37℃,培養48h后,發現克隆pro12周圍有明顯透明圈(圖1)。經反復驗證,克隆pro12周圍均有透明圈,而其他克隆周圍無透明圈存在,說明pro12中含蛋白酶基因。2.4lb固體培養基提取Fosmid克隆pro12的DNA,經EcoRⅠ和SPhⅠ雙酶切后,膠回收1.5—5kb大小的片段(圖略),連接到用相應的酶雙酶切后的pUC19載體上,轉化(用E.coliDH5α)后,涂板于LB固體培養基(含50mg/L氨芐青霉素)上,37℃,12h后,挑取盡量多的亞克隆,37℃,搖菌培養12h,將亞克隆轉接到LB固體培養基(含1%脫脂奶,50mg/L氨芐青霉素)上。經篩選,克隆espro124a5能夠降解脫脂奶(圖2)。說明克隆中含有目標蛋白酶基因。2.5研究的結果與討論結果顯示(表4,圖3),亞克隆espro124a5對靶標線蟲Meloidogynespp.具有較大的殺線蟲活性。在生物測定中,線蟲的致死率4h、8h、12h后的觀測結果分別為80%,99%和100%。12h后,能夠看到被破壞的線蟲角質。在所有陰性對照:陰性對照菌E.coli,LB液體培養基和培養物上清液煮沸25min,12h后,致死率下降到25%以下,并且這些對照中,死亡線蟲的角質完好無損。熱處理上清液對線蟲無活性,說明基因編碼的蛋白對線蟲起了一定的作用。表4中可以看出,espro124a5殺線蟲活性甚至強于陽性對照阿維菌素(Abamectin),說明蛋白酶espro124a5有較強的殺線蟲活性。2.6絲氨酸蛋白酶的結構編碼該蛋白酶的ORF序列全長1746個堿基,編碼581個氨基酸殘基的蛋白質,蛋白質分子量為61,353Da,G+C含量63.82%,等電點8.75,包含起始密碼子ATG和終止密碼子TAG(AccessionNo.GU556930atNCBI)。在其5′非編碼區無S-D序列(Shine-Dalgarno,SD),3′非編碼區無反向串聯重復序列(Tandeminvertedrepeatsequences)。在氨基酸序列中,23和24個氨基酸序列之間是其信號肽劈開位點。通過NCBI上blastx比對,發現espro124a5與來自于MaricaulismarisMCS10(accessionno.YP_75682.2atNCBI)的絲氨酸蛋白酶S15僅有45%的同源性,與另外一種不可純培養的Maricaulissp.(AccessionNo.ADD69818.1atNCBI)絲氨酸蛋白酶peptidaseS15僅有93%的同源性,是一種新型的絲氨酸蛋白酶,有其保守的催化三元組:Asp469,His541和Ser348。同時,espro124a5已在NCBI上登錄,并獲得核酸序列登錄號:GU556930。3宏基因組fosmid庫爾克氏體系的構建及對其的形成在宏基因組途徑中,最重要的一步是環境樣品基因組DNA的提取。到目前為止,沒有一個簡單統一的方案適合提取所有的環境樣品DNA。主要問題是DNA的數量,純度,完整性和DNA的代表性。DNA的提取方法有兩種:要么,通過堿裂解法直接從環境樣品中提取;要么,間接法,先從環境樣品中分離和濃縮微生物細胞,然后再進行堿裂解提取環境樣品DNA。對許多環境樣品來說,間接法是十分可取的。如對海洋水來說,直接從其中分離DNA是不實際的,因為微生物密度較低,因此,在濃縮細胞之前,通常進行一些過濾的操作。對土壤樣品來說,許多土壤的污染是非常嚴重的,例如,多酚類物質的污染能夠影響DNA的純化,也能影響宏基因組過程中隨后的步驟。Lindahl和Bakken報道用密度梯度分離液(Nycodenz)將微生物細胞分離出來,可以獲取基本上全部加入滅菌土中的測試細菌。據AcridineOrangeDirectCounts(AODC)方法估測,這種方法提取到的細菌細胞比單用洗滌/離心法得到的細胞提高了1%—50%,并且提取過程對細胞并不造成損傷。因此,為兼顧土壤DNA的純度和片段大小,本研究采取結合PVPP的Nycodenz密度梯度離心法提取溫室土壤微生物基因組DNA。先將分散的土壤懸液低速離心,去除大的土壤顆粒,然后高速離心收集上清中的細胞后,用PVPP洗滌1-3次,去除腐殖酸等雜質,最后,將細胞重懸液經Nycodenz密度梯度離心去除其余的土壤碎片及雜質,最終得到了足量的純凈微生物細胞。實驗結果表明,通過該法提取到的DNA純度高、片段長,完全能滿足構建宏