--1-凹凸分化胃癌組織的雙向凝膠電泳分析Protocol .-2-1試驗材料...........................................................................................................................-2-1.1標本采集................................................................................................................-2-1.2主要試劑：............................................................................................................-2-1.3主要儀器設備及軟件：........................................................................................-3-2試驗方法...........................................................................................................................-3-2.1標本采集................................................................................................................-3-2.2主要溶液配制........................................................................................................-3-2.3蛋白質樣品制備....................................................................................................-7-2.4Bradford.........................................................................................-8-2.5SDS-.........................................................................-9-2.6等濃度混合低分化腺癌組〔Pp〕高分化腺癌組〔Wp〕................................-10-2.7雙向凝膠電泳〔IEF+SDS-〕...................................................................-10-2.7.1第一向是等電聚焦電泳〔isoclectricfocusing，IEF〕..................................-10-2.7.2其次向SDS-電泳..................................................................................-11-2.8圖像分析..............................................................................................................-13-2.9差異蛋白點的切取..............................................................................................-13-凹凸分化胃癌組織的雙向凝膠電泳分析Protocol試驗材料標本采集33〔20094-10月，并經病理檢查確診WHO分型見表一。表一：6例胃癌標本病例資料序號編號住院號姓名性別年齡取材時間癌灶位置組織分型TNM分期臨床分期存放1張建442007張建男77090408胃竇低分T2bIIIa功A化N2M0-80℃2朱懷443253朱懷男61090420胃體低分T2bIIIa儀A化N2M0-80℃3閆茂444423閆茂男60090430胃體低分T2bIIIa金A化N2M0-80℃4柯玉446003柯玉女42090521胃體高分T2bIb花A化N0M0-80℃5任永懷4600101020A男61091020胃竇高分化T2bN1II-40℃M06王杭461295011027男34091027胃竇高中T2aIb杭王分化N02 周M0至-80主要試劑：超純尿素〔urea〕,十二烷基磺酸鈉(SDS)，丙烯酰胺(acrylamide)，甲叉-雙丙烯酰胺(Ｎ,Ｎ’-methylenebisacrylamide)，pH3-1017cm干膠條(IPGstrip),IPG緩沖液PH3-10N17cBio-Lyte,pH3-1(glycineTrisCHAPS兩性離子去垢劑)Bio-Rid公司；硫脲〔sulfocarbamide〕均購自sigma公司；蛋白酶--3-抑制劑completeEDTAfree(APS(DTT)碘乙酰胺(indoacetamide),，均購自上海生工。考馬斯亮藍G-250購自鵬程分裝Amersco、四甲基乙二胺(TEMED)購自鵬程Sigma分裝,小牛血清蛋白〔BSA〕購自北京索萊寶封裝Roche。甘油、甲醇、乙醇、冰乙酸、鹽酸、磷酸等均購自國產分析純試劑。主要儀器設備及軟件：Bio-RadproteinIEFcell型等電聚焦儀〔Bio-Rad公司產品〕Bio-RadproteinⅡXIcell型垂直電泳槽〔Bio-Rad公司產品〕PDQuest7.0軟件〔Bio-Rad公司產品〕低溫循環水浴箱凝膠成像系統〔〕臺式低溫高速離心機水平脫色搖床電子周密天平〔國產〕液氮罐超低溫冰箱-8℃Thermo公司產品超聲裂開儀酶標儀去離子水系統高溫高壓消毒鍋電熱恒溫鼓風枯燥箱磁力攪拌器PH測定儀去離子水系統可調式微量移液器：1000ul、200ul、20ul、2.5ul規格各兩支試驗方法標本采集3取下腫瘤組織后，切取約2g(2×2×3cm3)大小的胃癌組織，所取組織剔除結締組織，于冰鹽水或預冷的PBS液清洗干凈，濾紙吸去多余液體，分切成52mL凍存管內，標記后馬上放入液氮罐內，此過程在組織離體30分鐘內完成。試驗前轉移至-80℃冰箱備用。記錄患者姓名、性別、年齡、住院號、取材時間、癌灶位置、組織分型TNM分期、臨床分期。2.2主要溶液配制PBS緩沖液試劑 含量NaClKClNaHPO2 4KHPO2 4超純水

8.0g0.2g1.440.271000mlHCl調PH7.4，高壓消毒，室溫保存。蛋白酶抑制劑CompleteEDTA-free分裝：25×cocktail：試劑cocktail去離子水-20℃保存

含量1片〔50ml〕2ml10ml〔lysisbuffer〕試劑濃度含量尿素8M4.8048g硫脲2M1.522gCHAPS4%0.400gTris超純水40mM0.0485g10ml溶解混勻后每EP1ml,-20℃1ml試劑濃度含量25×cocktail4%40ulDTT65mM0.01gBioLyte2%5ul(0.2%)Bradford染色液〔儲藏液〕試劑95%乙醇88%磷酸考馬斯亮藍G2504℃避光保存，使用前濾紙過濾Bradford染色液〔工作液〕試劑Bradford儲藏液超純水濾紙過濾后避光室溫保存

含量50ml100ml100mg含量30ml200ml牛血清白蛋白〔BSA〕儲存液〔1mg/ml〕試劑 含量--10-牛血清白蛋白超純水溶解混勻后每EP1ml,-20℃保存。30%聚丙烯酰胺貯液試劑丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺超純水濾紙過濾后，棕色瓶4℃冰箱保存1.5mol/LTris堿pH8.8試劑Tris堿超純水

10mg10ml含量150g4g500ml含量90.75g400ml1mol/LHClpH8.8MilliQ500ml。4℃冰箱保存。1MTris-HClpH6.8試劑Tris堿超純水

含量121.1g800ml1mol/LHClpH6.8MilliQ1000ml。4℃冰箱保存。0.5mol/LTris堿pH6.8試劑Tris堿超純水

含量12g120ml1mol/LHClpH6.8MilliQ200ml。4℃冰箱保存。10%SDS試劑SDS超純水混勻后，室溫保存。10%Ap試劑過硫酸銨〔APS〕超純水溶解后，4℃冰箱保存。

含量10g100ml含量0.1g1ml10×電泳緩沖液〔1×=25mMTris，192mMglycine，0.1%SDS，pH8.3〕試劑含量Tris堿甘氨酸30g144gSDS10g超純水1L混勻后，室溫保存。1%溴酚藍試劑含量溴酚藍0.01g超純水1ml避光室溫保存2×SDS-上樣緩沖液試劑含量0.5MpH6.8Tris堿10%SDS2.0ml4.0ml甘油2.0ml1%溴酚藍0.05ml超純水DTT定容至10ml0.154g(用時現加)水化上樣緩沖液試劑濃度含量尿素7M4.0g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4g超純水10ml溶解混勻后每EP1ml,-20℃1ml試劑濃度含量DTT65mM0.01Bio-Lyte0.2%(w/v)5l40〕溴酚藍0.001%1ul(1%溴酚藍)膠條平衡緩沖液母液試劑濃度含量尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375MpH8.825ml〔1.5MpH8.8Tris-HCl〕甘油20%20ml超純水100ml1010ml，-20℃冰箱保存膠條平衡緩沖液I試劑膠條平衡緩沖液母液含量10mlDTT0.2g充分混勻，用時現配。膠條平衡緩沖液II試劑含量膠條平衡緩沖液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混勻，用時現配低熔點瓊脂糖封膠液試劑濃度含量低熔點瓊脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml〔10%SDS〕溴酚藍0.001%100l1溴酚藍〕超純水100ml加熱溶解至澄清，室溫保存考馬斯亮藍G250染色液試劑濃度含量CoomassieBlueG-2500.1%(w/v)1.0g甲醇40%(v/v)400ml冰醋酸10%(v/v)100ml超純水1000ml避光室溫保存考馬斯亮藍染色脫色液試劑濃度含量甲醇40%(v/v)400ml冰醋酸10%(v/v)100ml超純水1000ml室溫保存2.3蛋白質樣品制備試驗用品：眼科剪、鑷子、組織勻漿器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP管、冰盒、冰袋、1000u200ul、20ul、2.5ul規格各兩支試驗試劑：CHAPS、Tris、超純水、蛋白酶抑制劑CompleteEDTA-free、DTT、Bio-Lyte試驗標本：低分化腺癌組〔poorly〕32007、3253、4423，高分化腺癌組〔well〕3例：以住院號后四位標記：6003、0010、12951.5mlEP管、冰盒、冰袋、玻璃培育皿-20℃冰箱預冷。從-802007100mgEP500ul快速將組織剪成肉糜狀，再用一次性塑料小研磨棒快速充分研磨1min，直至管內物質變成組織懸濁液。應用超聲細胞裂開儀在冰浴下進展細胞裂開，運行120S〔80w,超聲1s,間隙3s，30個循環。盡可能少產生泡沫，4℃保存。裂解完畢后，4℃下，18000rpm,離心40min。用微量移液器留神吸取上清注入EP管中，混勻后，50ul分裝，-80℃凍存備用。53253、4423、6003、0010、1295依次依據上述步驟提取蛋白，留意提取每例樣本時要用75%酒精將培育皿，眼科剪、鑷子等接觸樣本的器械擦洗干凈。用超純水清洗超聲探頭，濾紙擦拭干凈。Bradford法蛋白質定量試驗用品：12各清潔的EP管、1215ml96孔板，可調式微量移液器：1000ul、200ul各一支、電子天平牛血清白蛋白BS〕儲存液1mg/m、Bradford染色液〔工作液試驗標本：50ul2007、3253、4423、6003、0010、1295六例標本各一管12EP12支離心管上標記：1、2、3、4、5、6、2007、3253、4423、6003、0010、1295，各管按下表所示依次參加各試劑序號BSA〔ul〕超純水(ul)混勻取出量(ul)Bradford染色工作液(ml)濃度(mg/ml)10100010050220080010050.2340060010050.4460040010050.6580020010050.86100001005120075951005325359510054423595100600359510050010595100512955951005Bradford20min3次，每200ul963個孔中。96孔放入酶標儀中，讀取OD595的吸光值。計算每管的平均值。EXCEL中以標準管的蛋白量為Y軸，吸光值為Y繪制標準曲線。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳100ml燒杯3個、水平搖床、電子天平、可調式微量移液器：5ml、1000ul、200ul、20ul、2.5ul規格各兩支、EP管假設干、水浴鍋、染色盤、脫色盤、長針頭、濾紙試驗試劑：30%聚丙烯酰胺貯液、1.5mol/LTris堿pH8.8、1mol/LTris堿pH6.8、10%SDS、10%Ap、TEMED、10×電泳緩沖液、1%溴酚藍、2×SDS-上樣緩沖液、考馬斯亮藍G250染色液、考馬斯亮藍染色脫色液試驗樣品：2007、3253、4423、6003、0010、1295蛋白各300g、Mark100ul溫水浴溶解結晶的10%SDS；洗凈晾干電泳槽、玻璃板〔干凈透光不掛水珠〕、安裝固5ml20ml水，觀看是否漏水，假設裝置嚴密不漏水，將水倒盡，開頭配膠。12%分別膠試劑超純水30%聚丙烯酰胺貯液1.5MTris(pH8.8)10%SDS10%APTEMED

含量〔80ml〕26.432200.80.8(現加)0.032〔現加〕 40ml，用5ml移液器沿玻璃板一側緩緩參加，避開氣泡產生〔假設有氣泡可用長針頭挑去。 封膠：用正丁醇〔或異丙醇、或超純水水〕封膠，用5ml移液器沿玻璃板一側緩緩加入，加滿。 聚合：靜置40min-60min(可過夜)。待分別膠凝固后，將正丁醇〔或異丙醇、或超純水〕倒盡，用超純水清洗膠頂部數次，濾紙吸凈水。 5%積層膠試劑超純水30%聚丙烯酰胺貯液1MTris(pH6.8)10%SDS

含量〔20ml〕13.63.42.50.210%APTEMED

0.2(現加)0.02〔現加〕10ml，用5ml移液器沿玻璃板一側緩緩參加，灌滿，避開氣泡產生〔假設有氣泡可用長針頭挑去。插入梳子。30min。變性：從-80℃冰箱中取出2007、3253、4423、6003、0010、1295蛋白樣品各300g，等體積11參加樣品及×SDS〔或1參加樣品及×SDS上樣緩沖液將加好上樣緩沖液的蛋白樣品及Mark3min〔插入冰浴冷卻后加樣。拔梳子，超純水清洗加樣空，用針頭撥正加樣空。101×電泳緩沖液，加滿電泳槽內槽，外槽加至槽的1/5。加樣：將2007、3253、4423、Mark、6003、0010、1295自左向右參加加樣空，其余孔參加等體積的上樣緩沖液。檢查一下電路連通狀況〔留意正負及〕，接通電源，以電壓為標準：起始時用低電壓〔80約30min(350v藍指示劑到達底部邊緣時即可停頓電泳。以電流為標準，開頭進樣的低電流為10mA/gel，待樣品在濃縮膠局部濃縮成一條線后，再加大電流到25mA/gel。電泳完畢后，輕輕撬開兩層玻璃，在左上角切角以作記號，取出凝膠〔將玻璃板斜立在防止凝膠裂開〔戴手套，防止污染膠面。染色：參加足量的考馬斯亮藍G-25060分鐘。染色完畢后棄去染色液。脫色：參加脫色液，在水平搖床上脫色，直至背景脫凈為止〔留意觀看，防止脫色過渡或不全。保存：可用10%的冰醋酸保存。成像：凝膠成像系統成像并保存圖像〔tif、jpg兩種格式。等濃度混合低分化腺癌組〔Pp〕高分化腺癌組〔Wp〕低分化腺癌組〔poorly〕3例：2007、3253、4423，以蛋白濃度最低的樣本為標準，用蛋白質裂解液稀釋其余兩管3800uPp(poorlypooling)表示。〔wel360030011295800ug以Wp(wellpooling)表示。雙向凝膠電泳〔IEF+SDS-〕第一向等電聚焦電泳〔isoclectricfocusing，IEF〕試驗用品：Bio-RadproteinIEFcell型等電聚焦儀、聚焦盤、水化盤、鑷子、可調式微量移液器：1000ul、200ul、規格各一支、電子天平、EP管DTBio-Lyt、IPG預制膠條pH3-10,17c試驗樣品：Pp800ug；Wp800ug洗凈、晾干聚焦盤或水化盤。從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液〔不含DTT，不含Bio-Lyte〕一小管〔1ml/管〕，置室溫溶解。在小管中參加0.01gDTT，Bio-Lyte5μl〔40%〕，充分混勻。從小管中取出水化上樣緩沖液，參加800μg樣品、并參加1.75ulIPGBuffer,共350ul充分混勻。從冰箱取-20℃冷凍保存的IPG預制膠條〔17cmpH3-10〕，于室溫放置10分鐘. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性參加樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液肯定要連貫。留意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。IPG膠條上的保護層。分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上,使得膠條的正極〔標有+〕對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極嚴密接觸。不要使樣品膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。在每根膠條上掩蓋2-3ml油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴漸漸加在塑料支撐膜上。對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。等電聚焦程序設置17cm膠條水化50V12-16〔20℃〕主動水化S1250V線性 30min除鹽S21000V快速 1h除鹽S310000V線性 5h升壓S410000V快速 60,000伏小時聚焦S5500V快速 任意時間保持選擇所放置的膠條數。設置每根膠條的極限電流。〔20μA/根〕〔留意：17cm膠條的極限電流不超過50μA/根，最好也在30μA/根以下〕設置等電聚焦時的溫度。〔20℃〕聚焦完畢的膠條。馬上進展平衡、其次向SDS-電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-80℃冰箱保存。SDS-電泳試驗用品：Bio-RadproteinⅡXIcell100ml3個、水平搖床、電子天平、可調式微量移液器：5ml、1000ul、200ul、20ul、2.5ul規格各一支、EP管假設干、水浴鍋、染色盤、脫色盤、長針頭，濾紙試驗試劑：試驗試劑：30%聚丙烯酰胺貯液、1.5mol/LTris堿pH8.8、10%SDS、10%Ap、TEMEDDTT10×電泳緩沖液、考馬斯亮藍G250染色液、考馬斯亮藍染色脫色液試驗樣品：第一向等電聚焦好的Pp組膠條；Wp組膠條溫水浴溶解結晶的10%SDS〔干凈透光不掛水珠、5ml20ml水，觀看是否漏水，假設裝置嚴密不漏水，將水倒盡，開頭配膠。12%80ml40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用超純水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平坦30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，說明凝膠已根本聚合。試劑超純水30%聚丙烯酰胺貯液1.5MTris(pH8.8)10%SDS10%APTEMED

含量〔80ml〕26.432200.80.8(現加)0.032〔現加〕待凝膠凝固后，倒去分別膠外表的超純水、乙醇或水飽和正丁醇，用超純水沖洗。從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。配制膠條平衡緩沖液I。樣品。這可以削減凝膠染色時消滅的縱條紋。5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖擺15分鐘。配制膠條平衡緩沖液II。第一次平衡完畢后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液〔將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠外表。再參加膠條平衡緩沖液II15分鐘。用濾紙吸去SDS-聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的其次向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下