第二章組織學根底

第一節組織學技術簡介

IntroductionofHistology組織的概念形態相似、功能相近的細胞與細胞間質結合在一起，形成組織。動物體四類根本組織：上皮組織結締組織肌肉組織神經組織

問題

解決方法

提高分辨率

顯微鏡保持組織的原始構造化學固定透光切片、涂片、鋪片、磨片增加反差

染色

區別不同生化成分組織化學、放射自顯影、原位雜交觀察生活狀態

培養組織學技術簡介1.光鏡技術〔lightmicroscope〕2.組織化學術〔histochemistry〕3.電鏡技術〔electronmicroscopy〕4.放射自顯影術〔autoradiography〕5.細胞培養術〔cellculture〕6.組織工程〔tissueengineering〕7.圖像分析術〔imageanalysis〕一般光鏡技術中常用三種制片方法１．涂片法液體材料，如血液、精液、各種分泌物、液體培養物等２．鋪片法易撕成薄片的材料，如疏松結締組織３．切片法將材料經處理后切成薄片1.光鏡技術①取材和固定②脫水和包埋③切片和染色④封片普通組織切片制作過程組織結構的立體形態與斷面形態材料塊適宜大小〔0.5cm3〕應用各種方法使組織標本盡量保持其離體前狀態的過程稱為固定。固定的目的和機制：①使蛋白質凝固，終止或減少分解酶的作用，防止自溶，保存組織、細胞的離體前結構狀態，包括保存組織或細胞的抗原性，使抗原不失活，不發生彌散。②保存組織、細胞內的蛋白質、脂肪、糖原、某些維生素及病理性蓄積物，維持病變的特異性特征。③使上述物質轉為不溶解狀態，防止和盡量減少制片過程中人為的溶解和喪失。④起助染作用。固定〔fixation〕１．物理學方法如低溫冷凍，干冰〔dryice，即固態無水碳酸〕冰凍真空脫水，石蠟滲入法。２．化學方法采用各種化學溶液作固定液，使組織細胞進入固定狀態。固定方法固定時間小標本〔如胃粘膜等〕2～4h，大標本應置放12～24h。常用固定液１．10％甲醛．２．中性甲醛液甲醛〔濃〕：120ml，水：880ml，NaH2PO4·H2O：4g，Na2HPO4：13g。３．AF液95％乙醇：90ml，甲醛(濃)：10ml。脫水：普通固定液大多是水溶液，必須先脫去組織內的水分，為浸蠟創造條件。脫水劑通常使用酒精。脫水的步驟是逐步升高酒精溶液的濃度，以去凈組織塊內的水分，最后完全由純酒精取代。10％甲醛液固定后的組織塊，脫水時應依次經過70％、80％、90％、95％酒精和無水酒精。透明：因石蠟不溶于酒精而溶于二甲苯，因而組織塊經脫水后須再用二甲苯置換出酒精。組織塊浸入二甲苯后逐漸變得透明，故此步驟稱為透明。透明時間根據組織塊的大小及性質而定。浸蠟：溫箱〔58～60℃〕內熔化的石蠟，將透明好的組織塊置入，放置適當時間，使石蠟浸入組織并替換出二甲苯。包埋：在包埋器的內壁涂一層甘油，傾入熔化的石蠟，將浸透蠟的組織塊放入包埋器，擺好間距和方位，俟蠟液外表凝固后，將包埋器投入冷水浴中，使石蠟冷卻凝固。包埋后的組織蠟塊，經過修整即可用于切片。普通輪轉式切片機冰凍切片機切片：在切片機上將包有組織的蠟塊切成5-6微米的薄片。取下一段蠟帶，置于涂布一層蛋白甘油的載玻片上，滴上適量水，于酒精燈上徐徐加溫，至蠟片在水面展平，別離每張蠟片，傾去水，擺好蠟片位置，放入烤片箱。俟蠟片枯燥并牢固地附著于載玻片后，即可取出，進行染色。染色染色的目的是使組織內的不同結構染上不同顏色以便于在顯微鏡下觀察。染色步驟〔蘇木精-伊紅染色法為例〕：注：脫蠟后，假設組織是用含汞的固定液〔如Susa液、Helly液〕固定，切片還須經含碘的70％酒精脫汞后再入70％酒精及蒸餾水。普通染色法即蘇木精-伊紅染色法〔hematoxylin-eosinstaining，HE染色法〕：蘇木精為堿性染料，使染色質和核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，使胞質和細胞外基質著紅色嗜酸性〔acidophilia)；嗜堿性(basophilia)HE染色，垂體遠側部鍍銀染色：硝酸銀→神經細胞(黑)鍍銀染色，示小腦皮質神經元醛復紅與偶氮焰紅染色，示肥大細胞和彈性纖維醛復紅與偶氮焰紅染色染色步驟〔HE染色法為例〕：注：脫蠟后，假設組織是用含汞的固定液〔如Susa液、Helly液〕固定，切片還須經含碘的70％酒精脫汞后復水。封固從二甲苯中取出切片，在切片的組織上滴加適量樹膠，上面再加一蓋玻片，使樹膠布滿于蓋玻片與載玻片之間的間隙，封固即告完成。將封好的切片標本放入烤箱，待蓋玻片粘著牢固后，即獲得可供長期觀察和保存的染色標本。

應用化學、物理、生物化學、免疫學或分子生物學的原理和技術，與組織學技術結合而產生，在組織切片顯示某種物質的存在和分布狀態。分類：一般組織化學術免疫組織化學術原位雜交術２.組織化學術〔histochemistry〕一般組織化學術根本原理是在切片上加某種試劑，和組織中的待檢物質發生化學反響，其最終產物或為有色沉淀物，以用光鏡觀察，或為重金屬沉淀，以用電鏡觀察。一般組織化學術糖過碘酸多醛席夫試劑PAS反應小腸上皮杯狀細胞的粘原顆粒紫紅色反應產物例１糖類：PAS〔過碘酸希夫〕反響，顯示多糖和糖蛋白，呈紫紅色例２酶類：酶與特異性底物的反響產物、再與捕捉劑反響，形成有色的沉淀物聯苯胺法：粒細胞和單核細胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態氧，使無色的聯苯胺形成藍色沉淀。

過氧化物酶染色

例３蘇丹黑B(sudanblackB,SB)是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細胞內的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使細胞內微細結構的脂類物質也能顯示出來。

蘇丹黑B染色

組織細胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍色

例4油紅O染脂類例5甲基綠－派假設寧反響同時顯示DNA與RNA免疫組織化學〔immunohistochemistry〕根據抗原、抗體特異性結合原理，用標記的抗體與組織中的抗原結合，標記物可于顯微鏡下觀察，檢測組織切片中的肽和蛋白質。標記物有：熒光素〔熒光顯微鏡觀察〕辣根過氧化物酶〔光鏡或電鏡觀察〕膠體金〔多用于電鏡觀察〕免疫組織化學原理模式圖熒光素標記

毛細血管內皮細胞呈陽性辣根過氧化物酶標記胰島B細胞呈胰島素陽性膠體金標記金顆粒沉積在胰淀粉酶原顆粒部位原位雜交術〔insituhybridization〕即核酸分子雜交組織化學術，檢測基因〔DNA片段〕的有無、基因的表達活性〔mRNA〕原位雜交臍靜脈內皮細胞呈心房鈉尿肽陽性原理：用帶標記物的堿基順序的核酸探針與細胞內待測核酸按堿基配對原那么進行特異性原位結合〔雜交〕，并通過對標記物的顯示而獲知待測核酸的有無及相對量。常用標記物有放射性核素和地高辛用于觀察組織細胞的超微結構戊二醛、鋨酸雙重固定→樹脂包埋→超薄切片〔50-80nm厚〕→電子染色〔醋酸鈾、檸檬酸鉛〕根據電子束在不同結構上被散射程度的差異表現為電子密度高〔黑或深灰色〕和電子密度低〔淺灰色〕透射電鏡圖，漿細胞透射電鏡術〔transmissionelectronmicroscopy,TEM〕3.電鏡技術用于觀察組織細胞外表構造，具有真實的立體感，無需制備切片掃描電鏡圖，血細胞掃描電鏡術〔scanningelectronmicroscopy,SEM〕概念：通過活細胞對某種放射性物質的特異性攝入，以顯示該物質在組織和細胞內的分布、含量和代謝過程，借以反映細胞的功能狀態例用3H標記的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和細胞增殖狀態4.放射自顯影術〔autoradiography〕5.細胞培養術〔cellculture〕把從機體取得的細胞在體外模擬體內的條件下進行培養；培養組織塊或器官那么稱組織培養術或器官培養術用于研究細胞、組織的代謝、增殖、分化、形態和功能變化，各種理化因子對活細胞的影響用相差顯微鏡觀察體外培養的HeLa細胞體外培養的平滑肌細胞〔免疫組織化學染色顯示肌動蛋白〕6.組織工程〔tissueengineering〕用細胞培養術在“體〞外模擬構建機體組織或器官的技術。研究包括四個方面：①種子細胞，即增殖旺盛的細胞，多為干細胞②細胞外基質，可用生物材料〔如牛膠原〕和人工合成高分子材料③構建組織或器官，即把細胞置于細胞外基質中進行三維培養、并形成所需要的形狀④將構建物移植機體的方法正在構建的有皮膚、軟骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管、角膜等；其中以組織工程皮膚較為成功，已成為商品用于治療燒傷、皮膚靜脈性潰瘍等疾病實驗中的組織工程耳7.圖像分析術〔imageanalysis〕圖像分析術又稱形態計量術〔morphometry〕，是應用數學和統計學原理對組織切片提供的平面圖像進行分析，從而獲得立體的組織和細胞內各種有形成分的數量、體積、外表積等參數,從量的角度顯示結構與功能的關系。目前廣泛應用的圖像分析儀可快