姜酚對牛ii型膠原誘導性關節炎大鼠的抗炎作用

風濕性關節炎（ra）是一種常見的自身免疫性疾病，由多關節滑膜慢性炎癥引起，滑膜纖維母細胞增生，大量淋巴結、肝細胞和漿細胞浸潤。目前，還不清楚疾病的機制。近年來諸多研究表明,部分免疫細胞及其分泌的細胞因子在RA的滑膜炎癥反應、血管翳形成和骨質的破壞起了非常重要的作用。本研究通過建立膠原誘導性關節炎(CIA)模型大鼠,觀察姜酚對CIA模型大鼠關節炎癥及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-1β(IL-1β)的影響。1材料和方法1.1動物6周齡Wistar大鼠40只,雌性,體質量(160±20)g,重慶滕鑫生物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2009-0004。1.2試劑盒和姜酚牛II型膠原(CollagenTypeII,批號:C7806-2)、弗氏完全佐劑(Freund謘scompleteadiuvant,FCA,批號:F5881),美國Sigma公司;TNF-α、IL-1、IL-1βELISA試劑盒,美國ADL公司,批號:RT110371;姜酚,貴州百靈企業集團制藥股份有限公司,批號:20120308142128663;雷公藤多苷片,湖南協力藥業有限公司,批號:20101101。1.3酶聯免疫檢測dg5033aLD25-2自動平衡離心機,北京醫用離心機廠;DG5033A酶聯免疫檢測儀,上海同舸工貿有限公司。YLS-7B大鼠足趾容積測量儀,淮北正華生物儀器設備有限公司,校零誤差:≤±5μL。1.4iii型膠原原激活劑iii參照文獻方法,用電子秤稱取牛II型膠原20mg置于試管中,加入0.1mol·L-1醋酸5mL攪拌混勻,再加入弗氏完全佐劑5mL充分混合乳化,制成2mg·mL-1的II型膠原抗原注射液,于每只大鼠尾根部及背部多點注射0.2mL,同時于大鼠膝關節注射0.1mL,第7天和第15天加強免疫2次,每天觀察大鼠關節腫脹程度。1.5模型組和給藥Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、姜酚組(0.21mg·kg-1)和雷公藤多苷陽性對照組(7mg·kg-1),每組10只。致炎21d后灌胃給藥,空白對照組和模型組給予等容積生理鹽水。給藥28d后,斷頭處死大鼠采血,離心取血清用于細胞因子活性測定,取大鼠膝關節滑膜及軟骨于10%的中性福爾馬林固定,用于病理檢測。1.6踝骨號測量足水腫度于致炎前用水容積置換法測量各組大鼠雙后肢踝關節毛際以下容積,取平均值,致炎后再次測量雙后肢踝關節毛際以下容積,每周1次,計算足腫脹度(腫脹度=致炎后足跖容積-致炎前足跖容積)。1.7膝關節評分采用關節炎指數積分法評定,根據關節紅腫程度和范圍以及關節腫大變形情況進行評定:0分,無關節受累;1分,一個關節或關節區受累(出現關節紅腫);2分,兩個關節或兩個關節區受累;3分,兩個或兩個以上關節區受累;4分,整個肢體受累;4只肢體評分相加得到關節炎總分。關節區為趾骨關節、跗骨關節、踝關節。1.8脫鈣、he染色取CIA大鼠右膝關節滑膜及部分軟骨置于10%的中性福爾馬林中固定,8%EDTA溶液脫鈣,常規梯度脫水、浸蠟、包埋、切片,HE染色。光鏡下觀察關節滑膜細胞和血管的增生,滑膜層及滑膜下層淋巴細胞浸潤和軟骨的增生及破壞等情況。1.9封板時封板的制備采用ELISA法,按照ELISA試劑盒說明書進行操作,先加入標準品和待測樣品,設置陰性對照,用封板膜封板后置37℃溫育30min,揭去封膜,棄去液體,甩干,加洗滌液重復洗板5次。加入酶標試劑,再次置37℃溫育30min,洗板5次,加顯色液A、B各50μL,37℃避光顯色15min,加入終止液終止反應,于450nm波長酶標儀檢測吸光度(OD值)。1.10方差齊時,方差齊時,tamhencesc2檢驗采用SPSS15.0統計軟件,多組間比較用單因素方差分析,方差齊時,各組間兩兩比較采用LSD檢驗,方差不齊時,則采用Tamhance謘sT2檢驗,P<0.05表示差異有顯著性意義,P<0.01表示差異有非常顯著性意義。2結果2.1異有顯著性意義模型組大鼠踝關節腫脹明顯,雙后肢踝關節腫脹,與空白對照組比較差異有顯著性意義(P<0.05,P<0.01)。給藥1~4周,姜酚組和雷公藤多苷組大鼠踝關節腫脹均有明顯減輕(P<0.05,P<0.01),兩給藥組間比較無統計學意義(P>0.05),見表1。2.2膝關節指數積分大鼠致炎后20d至給藥后14d,各組關節炎指數積分無顯著性意義,且隨著免疫時間延長,關節炎指數積分增加。給藥第3周(21d)后,姜酚組和雷公藤多苷組關節積分明顯低于模型組(P<0.01),兩給藥組間比較差異無顯著性意義(P>0.05),見表2。2.3術中新生血管及滑膜的變化空白對照組大鼠膝關節滑膜未見明顯的血管擴張、增生及炎細胞浸潤。模型組滑膜組織可見明顯的血管增生、增厚、炎細胞浸潤、水腫,軟骨組織增生。姜酚組滑膜組織可見少量新生血管及滑膜輕度增生,未見炎細胞浸潤、水腫,軟骨組織可見輕度增生及關節面骨質損傷,未見骨小梁結構改變。雷公藤多苷組可見較多滑膜血管新生和部分炎性細胞浸潤、水腫,見圖1。2.4組明顯降低p>0.1與空白對照組比較,模型組TNF-α、IL-1、IL-1β明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,姜酚組、雷公藤多苷組TNF-α、IL-1、IL-1β水平明顯下降(P<0.01);兩給藥組間比較差異無顯著性意義(P>0.05)。3ra系統作用機制RA是以對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、進行性、侵襲性疾病,進行性的關節結構破壞為其病理學的主要特點,其主要原因是血管翳的形成及骨的侵蝕,主要的病理變化為關節滑膜的慢性炎癥,初期滑膜充血、水腫、增厚,血管翳形成,軟骨和軟骨下骨破壞。在其發病過程中主要發生T細胞免疫反應、滑膜細胞免疫反應、細胞因子的自分泌及旁分泌作用、B細胞產生自身抗體等。RA病變關節局部免疫細胞、炎性細胞、細胞因子、炎癥介質等大量聚集,尤其是Th細胞及其所分泌的細胞因子在RA發病和整個病程中起著非常重要的作用。過量的Th1細胞因子可引起局部慢性炎癥和基質破壞,其中TNF-α、IL-1是2種主要的促炎細胞因子,它們在類風濕血管翳的形成中共同起到“中心罪犯”的作用。在RA時IL-1和TNF-α均可以刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產生包括基質金屬蛋白酶(MMP)在內的炎性介質,從而降解關節軟骨、蛋白多糖、膠原。IL-1和TNF-α協同作用刺激內皮細胞表達黏附分子,增加白細胞由血流向關節的移動。此外,在IL-1和TNF-α的共同作用下,滑膜巨噬細胞可以進一步分化為破骨細胞,導致邊緣骨質的破壞。而IL-1β在RA早期能增加內皮細胞間黏附分子的表達,誘導中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞的趨化,誘導IL-6參與免疫調節過程,刺激成纖維細胞的增生。RA關節腔損傷機理中,IL-1β的局部生物效應發揮充分,IL-1β進一步誘導成纖維細胞和軟骨的前列腺素E2、膠原酶的產生,增強破骨細胞活性,促進關節軟骨和骨破壞。姜酚是生姜中提取的主要辣味物質,包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等10余種成分,這些成分分子結構類似,都有β-羥基酮結構。姜酚以6-姜酚含量最高,其生物活性也最強。6-姜酚通過抑制花生四烯酸代謝過程中環氧酶及脂氧酶,減少炎性介質前列腺素和白三烯的生物合成,拮抗佐劑性關節炎大鼠產生原發性和繼發性炎癥反應。我們根據其抗炎作用機制,將姜酚用于治療類風濕關節炎,研究結果顯示姜酚對RA有較好臨床療效,能夠明顯改善RA患者關節疼痛、關節壓痛指數、關節功能、關節腫脹及僵晨時間,并能夠降低血沉、C反應蛋白。本研究結果顯示,模型組大鼠踝關節腫脹明顯,滑膜關節組織可見血管增生、增厚,炎細胞浸潤、水腫,軟骨組織增生,關節炎指數積分逐漸增加,于免疫后41d左右達到高峰,說明造模成功。姜酚組大鼠踝關節腫脹明顯減輕,關節滑膜組織可見輕度新生血管及滑膜增生,無明顯炎細胞浸潤、水腫,關節炎指數積分明顯下降,說明姜酚能夠抑制CIA大鼠關節