第第頁肝陽上亢型高血壓模型及評價初探【摘要】為更好的應(yīng)用于疾病實(shí)驗(yàn)研究,預(yù)期達(dá)到病癥結(jié)合的目的,對肝陽上亢型高血壓模型的建立方法進(jìn)行總結(jié)并對其評價指標(biāo)予以歸納和探索。

【關(guān)鍵詞】肝陽上亢高血壓模型評價

Abstract:Inordertobetterservediseaseexperimentalresearchandreachforecastedcombinationofdiseaseandsymptoms,itsumsuptheestablishmentofhypertensionmodelofhyperactionofliverYang,andmakesexplorationandinductiontoitsevaluationindex.

Keywords:hyperactionofliverYang;hypertension;model;evaluation

從歷年來文獻(xiàn)中報(bào)道過的具有“病證結(jié)合”特征的高血壓肝陽上亢證動物模型,并總結(jié)其評價指標(biāo)——癥狀和體征、組織學(xué)檢查、相關(guān)生化指標(biāo)和神經(jīng)遞質(zhì)檢測和方藥測證。

1模型的建立

1.1黃文權(quán)等[1]采用多巴胺靜脈注射法模擬肝陽上亢證實(shí)驗(yàn)動物模型,并以生理鹽水作為對照,方法簡便易行,是國內(nèi)外公開報(bào)道的首例,但該模型維持時間短,各觀測指標(biāo)均于停藥3~4d后完全恢復(fù)正常,因而其應(yīng)用受到很大限制。

1.2肖純等[2]采用雙腎雙夾加灌附子湯復(fù)制的高血壓肝陽上亢證模型,基本符合肝陽上亢證的病因病機(jī),且出現(xiàn)了類似肝陽上亢證臨床表現(xiàn),如眩暈、口渴、煩躁易怒等癥狀和血漿去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)顯著升高,腦干NE明顯增高等神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo),該模型具有“疾病”、“證狀”、“病理生理”結(jié)合特征,但手術(shù)損傷較大,容易造成動物死亡。

1.3鄢東紅等[3]選用自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)加灌單味附子湯4周,造成高血壓肝陽上亢證模型。附子乃辛甘大熱之品,能溫一身之陽,久用必耗傷精血,奪肝腎之陰而致肝腎陰虛,陰不潛陽而肝陽偏亢,因此采用灌服附子湯4W的方法是依據(jù)肝陽上亢證的病因病機(jī)設(shè)計(jì)的。SHR肝陽上亢證模型具有血壓穩(wěn)定升高、易激惹程度增加、飲水量增加、旋轉(zhuǎn)時間縮短、痛閾降低、腎小動脈硬化等近似人類高血壓病肝陽上亢證的特征。是一種操作簡單,重復(fù)性好,具有“病”“證”結(jié)合特征的動物模型。這種模型建立的方法,被模仿的最多,但SHR的價格比普通的大鼠高近10倍。

1.4何綱等[4]采用慢性束縛應(yīng)激法[5]結(jié)合懸吊應(yīng)激法[6]造成肝腎陰虛證,用雙腎雙夾法制備腎血管性高血壓。所有模型大鼠均血壓明顯升高;出現(xiàn)煩躁、易激惹、眼結(jié)膜深紅、頭暈、口渴、大便干結(jié)等癥狀或體征。束縛應(yīng)激大鼠模型[5]是一種心理性應(yīng)激模型。中醫(yī)學(xué)形神統(tǒng)一觀認(rèn)為,形受束縛則情志易郁怒,故理論上認(rèn)為該模型符合人類肝氣郁結(jié)病因病機(jī)。喬明琦等[7]對束縛應(yīng)激大鼠的整體反應(yīng)及疏肝理氣中藥療效觀察結(jié)果表明,該模型的中醫(yī)證型為肝氣郁結(jié)。包天桐[6]研究表明,懸吊應(yīng)激小鼠具有類似中醫(yī)“腎虛證”的某些病理變化,可用于補(bǔ)腎藥及其他補(bǔ)益藥的研究。因此,本研究中對大鼠實(shí)施束縛加懸吊應(yīng)激,試圖模擬人類肝氣郁結(jié)證肝腎陰虛證的發(fā)生、發(fā)展過程。該模型能夠部分模擬人類高血壓肝陽上亢證的病因病機(jī)和發(fā)病特點(diǎn)。

1.5王欽茂[8]等采用溫里藥、麻黃堿和鹽水復(fù)合法給大鼠造模,前者為“肝陽上亢”證所設(shè),不能引起高血壓;鹽水則相反。又因麻黃屬解表藥,與證型不符而選用麻黃堿,它可升壓又有擬交感作用,但單用時模型成功率較低,且動物死亡率高。三種因素綜合應(yīng)用后,大鼠除血壓升高外,出現(xiàn)煩燥不安、易激怒、尖叫,同籠動物相互撕打、咬人等攻擊行為,并且飲水量和排尿量增加,尿內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)升高,具有交感腎上腺髓質(zhì)功能增強(qiáng)表現(xiàn),以及cAMP升高,及6酮前列腺素F1α/血栓素B2比例下降等三項(xiàng)主要指標(biāo)的改變,與臨床上基本一致。造模無需手術(shù),其成功率約80%,時間為4周左右,此后血壓趨向穩(wěn)定。

可見模型的建立基本可以歸納為以下兩個方面,一方面是制造肝陽上亢模型的方法,包括①使用一種或幾種溫里藥、②應(yīng)激法、③兒茶酚氨類等具有擬交感作用的物質(zhì)(多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素或者麻黃堿)的使用;另一方面是高血壓模型獲得的方法[9]。這方面的研究已經(jīng)比較成型,主要種類有①腎性高血壓模型;②內(nèi)分泌性高血壓模型;③神經(jīng)原性高血壓模型;④遺傳性高血壓模型。當(dāng)這兩方面相結(jié)合時,就獲得了征型結(jié)合的肝陽上亢型高血壓模型。

2模型的評價

分成兩方面,其一是對高血壓模型的評價,國內(nèi)外已廣泛使用各種測量動物血壓的儀器,測量和評價方法也比較成熟[9];其二是檢測動物肝陽上亢模型的形成。

2.1臨床具體癥狀指標(biāo)及評定方法

2.1.1陳華德等[1012]中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》(國家技術(shù)監(jiān)督局1997年發(fā)布),主要證候?yàn)檠灐㈩^痛、面紅目赤或面部烘熱、煩躁易怒、口苦而渴、脈弦。具有以上6項(xiàng)中4項(xiàng)主癥者,無或兼1~2項(xiàng)肝腎陰虛癥狀者即可辨為肝陽上亢證。這是被普遍肯定的評價方法。

2.1.2張亞東等[13]參考《實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》所制定的辨證標(biāo)準(zhǔn)[14],通過臨床觀察及流行病學(xué)調(diào)查,參照現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法,將證候分為主癥和次癥兩類,制定出肝陽上亢證的辨證標(biāo)準(zhǔn)。即主癥:眩暈,頭痛,面部烘熱,煩躁或情緒易激動,脈弦;次癥:口干苦,耳鳴,肢麻,失眠,舌紅或絳,苔黃或膩,脈細(xì)數(shù)有力。認(rèn)為在上述病癥中若有4項(xiàng)主癥合2項(xiàng)次癥,或2項(xiàng)主癥合3~4項(xiàng)次癥,即可辨為肝陽上亢證。此法包括的癥狀較多但臨床應(yīng)用不多。

2.1.3陳國林等[15]制定的肝陽上亢證辨證標(biāo)準(zhǔn)為①眩暈;②頭痛;③面部烘熱;④煩躁易怒;⑤口苦而渴;⑥脈弦。以上6項(xiàng)中具有4項(xiàng),無或兼有1~2項(xiàng)肝腎陰虛癥狀(記分不超過3分以便與肝腎陰虛證鑒別)辨證項(xiàng)記分超過10分。記分標(biāo)準(zhǔn)為:將癥狀程度分為無、輕、中、重、嚴(yán)重5級,分別記0、1、2、3、4分,無法記分的癥狀如味覺、面色等記有無,分別記1、0分,舌脈與證相符的記1分,不相符的記0分。此方法雖然選用記分的方法以求量化,但因?yàn)榘Y狀等級區(qū)分難以確定而不很實(shí)用。

2.2據(jù)上而擬定實(shí)驗(yàn)動物模型的篩選癥狀指標(biāo)為:

2.2.1外觀和性情變化(與其對應(yīng)的人的癥狀為第④項(xiàng)煩躁易怒)

2.2.1.1外觀指毛色是否有光澤及雙眼結(jié)合膜顏色是否加深變紅[24,10,16]

2.2.1.2性情變化根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的分類方法主要有3種,易激惹程度都分為3級。方法一[23,10,16]:Ⅰ級指捉持頸部時尖叫、驚跳;Ⅱ級指捉持頸部時咬人;Ⅲ級指提尾時尖叫、驚跳甚至咬人或同籠大鼠頻繁打斗;方法二[7]:1級:喜跳躍;2級:在1級基礎(chǔ)上加喜抓鐵籠;3級:在2級基礎(chǔ)上加咬人、咬鐵籠。方法三[10]:Ⅰ級指活動增加、經(jīng)常有跳躍和咬鐵籠行為;Ⅱ級指在Ⅰ級基礎(chǔ)上,兼有捉持頸部時尖叫、驚跳;Ⅲ級指在Ⅱ級基礎(chǔ)上,兼有同籠大鼠頻繁打斗行為。

2.2.2飲水量[2,4,10,16](與其對應(yīng)的人的癥狀為第⑤項(xiàng)口苦而渴)每個鼠籠放大鼠1只,用相同容積的水瓶供水,24h前后水瓶重量的變化值即為每日飲水量。

2.2.3痛閾(與其對應(yīng)的人的癥狀為第

②項(xiàng)頭痛)采用熱板測痛法[10],熱板溫度為55.0℃±0.5℃,從大鼠放入開始到舔后足底/后腳爪或跳躍運(yùn)動所經(jīng)歷的時間為痛閾。或采用尾電刺激法[17],用痛閾測量儀作方波脈沖電流刺激:頻率8Hz,波寬2ms,電壓從零開始,由低到高直至大鼠出現(xiàn)嘶叫,以此時的電壓值為痛閾。

2.2.4周圍血管充盈(與其對應(yīng)的人的癥狀為第③項(xiàng)面部烘熱)分為Ⅲ級[1]:Ⅰ級:雙耳及頭頸部毛細(xì)血管充盈,Ⅱ級:在Ⅰ級基礎(chǔ)上加軀干部毛細(xì)血管充盈,Ⅲ級:在Ⅱ級基礎(chǔ)上加四肢毛細(xì)血管充盈,腹壁靜脈輕度怒張。

2.2.5心臟血流動力學(xué)測定[18]其中的心率即脈搏數(shù)(與其對應(yīng)的人的癥狀為第⑥項(xiàng)脈弦)氨基甲酸乙酯ip麻醉,分離右側(cè)頸總動脈,插入充滿肝素生理鹽水導(dǎo)管至左心室,另股動脈插管測血壓。聯(lián)壓力換能器,同步輸入多功能信號處理系統(tǒng)。記錄心率(HR)、收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、左室壓(LVSP)、左室最大變化速率(±dp/dtmax)、左室舒張期末壓(LVEDP)等指標(biāo)。此外,經(jīng)顱多普勒檢測大腦中動脈平均血流速度、收縮峰血流速度增高。高血壓肝陽上亢證白天血壓高于夜間[16]。

2.2.6旋轉(zhuǎn)時間(與其對應(yīng)的人的癥狀為第①項(xiàng)眩暈)根據(jù)文獻(xiàn)[24,19]方法自制旋轉(zhuǎn)平臺,將大鼠置于旋轉(zhuǎn)平臺上,分3次每隔10s調(diào)速1次,轉(zhuǎn)速分別為15、30、45r/min,記錄跌下時間,若2min仍不跌下則停止測試。

2.2.7其他可以觀察大便性狀、舌象[4];尿量[8];心、腎臟器檢測,計(jì)算臟器系數(shù),并作腎臟病理組織學(xué)觀察[3]:先10%福爾馬林固定,再石蠟包埋,切片(5Lm),常規(guī)HE染色,在光鏡下觀察有無腎入球小動脈硬化及腎小球萎縮等。

2.2.8模型的神經(jīng)遞質(zhì)及生化指標(biāo)

為更加全面客觀的評價模型,可以參考的神經(jīng)遞質(zhì)及生化指標(biāo)有。

2.2.8.1血漿NE、E及腦干NE、5HT測定肝陽上亢證最主要的病理生理基礎(chǔ)為外周交感——腎上腺髓質(zhì)功能偏亢[20],表現(xiàn)為血、尿兒茶酚胺增高,肖純等[2]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝陽上亢組模型大鼠出現(xiàn)與此相同的病理生理變化,血漿NE、E顯著升高。腦內(nèi)NE、5HT的動態(tài)平衡與中樞痛閾的升降變化及情緒波動有密切關(guān)系[21]:當(dāng)腦內(nèi)NE明顯升高和(或)5HT明顯下降時,將使痛閾明顯下降造成頭痛,并出現(xiàn)煩躁易怒、躁狂、攻擊行為等,本模型大鼠腦內(nèi)NE明顯升高、5HT明顯下降,可能是肝陽上亢證發(fā)生頭痛、煩躁易怒等證侯的重要機(jī)制。所有動物均于實(shí)驗(yàn)第8周末斷頭處死,將血液在4℃3000r/min離心15min,分離出血漿,放-80℃冰箱中保存待測,采血同時迅速剝離腦組織,分離出腦干放入液氮中冷凍1w,再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中待處理。

2.2.8.2血清睪酮、血漿腎素活性(PRA)、血管緊張素II(AII)、醛固酮方藥測證研究結(jié)果提示,腎血管狹窄高血壓大鼠模型屬腎陰虛型高血壓,并發(fā)現(xiàn)大鼠血漿醛固酮水平增高[22]。本模型[4]大鼠血漿醛固酮含量同樣顯著增高,為其存在陰虛證提供了客觀依據(jù)。而腎陰虛是肝陽上亢兩個成因之一,另一是肝陰虛。從懸吊應(yīng)激導(dǎo)致小鼠性行為低下及血漿睪酮水平明顯降低。模型大鼠血清睪酮含量也明顯降低,說明該模型具有腎虛證的生化改變。同時,腎素活性和血管緊張素水平也顯著增高,變化趨勢相似。這些結(jié)果說明,該模型具有陰虛陽亢的病理基礎(chǔ)。腎素—血管緊張素系統(tǒng)在機(jī)體的血壓及水、電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)上起著重要的作用。黃文權(quán)等[1]用多巴胺靜脈注射方法制備兔肝陽上亢模型,發(fā)現(xiàn)模型兔血漿腎素活性和血管緊張素II含量明顯升高,說明PRA及AII的升高可能為肝陽上亢證型的重要客觀指標(biāo)之一,可作為臨床辨證的參考依據(jù)[1]。本模型大鼠血漿腎素活性和血管緊張素II含量也顯著升高,與之符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,大鼠血漿去甲腎上腺素和腎上腺素水平顯著升高,與雙腎雙夾加灌附子湯法制備的高血壓肝陽上亢證大鼠模型[8]的變化趨勢一致。血漿去甲腎上腺素主要來源于血管交感神經(jīng)末梢,血漿腎上腺素來自腎上腺髓質(zhì)。我們推測,懸吊、束縛等強(qiáng)烈應(yīng)激使大鼠交感神經(jīng)興奮,腎上腺髓質(zhì)功能亢進(jìn),使腎上腺素釋放增加,并導(dǎo)致腎素活性增強(qiáng)、血管緊張素水平增高,可能是本模型具有肝陽上亢證的重要生化基礎(chǔ)。

2.2.8.3血清一氧化氮(NitricOxide,NO)NO是血管內(nèi)皮依賴的松弛因子,為主要的擴(kuò)血管物質(zhì),它具有強(qiáng)大的舒張血管的作用,血管內(nèi)皮細(xì)胞通過合成和釋放NO來維持和調(diào)節(jié)血管的舒張,保持血壓的相對穩(wěn)定。抑制NO的基礎(chǔ)釋放,可引起外周血管收縮,導(dǎo)致血壓升高。NO生成減少,除可直接導(dǎo)致水鈉潴留外,還可使血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮源性收縮因子TAX2、PGH2生成增多,對自由基的消除能力也減弱,過多的自由基引起脂質(zhì)過氧化,從而參與高血壓的發(fā)展。陳華德等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型對照組在造模成功后血壓普遍升高,其血清NO濃度亦顯著低于空白對照組,可見血壓與血清NO濃度的相關(guān)性。運(yùn)用硝酸還原酶法測定。NO化學(xué)性質(zhì)活潑,在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)為NO2和NO3,而NO3又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO2,本法利用硝酸還原酶特異性將NO3還原為NO2,通過顯色深淺測定其濃度的高低。在第6周周末治療結(jié)束后,采用摘除眼球法取血,取大約2ml血液于普通玻璃試管中,溫度為4℃,3000r/min下離心15min,分離出上清液,待測。具體操作按說明書進(jìn)行。

2.2.8.4尿內(nèi)3甲氧腎上腺素(TMN)、NE;血漿內(nèi)環(huán)核甘酸(cAMP)、血栓素B2(TXB2)、及6酮前列腺素F1α(6kPGF1α)一般認(rèn)為交感神經(jīng)、腎素血管緊張素系統(tǒng)對血壓調(diào)節(jié)起著主要作用。兒茶酚胺、AⅡ、TXB2具縮血/－中國最強(qiáng)免費(fèi)文秘網(wǎng)！/管作用,而PGI2有擴(kuò)血管作用。王欽茂等[8]的實(shí)驗(yàn)表明肝陽上亢型高血壓動物主要出現(xiàn)尿內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)TMN、NE升高,具有交感-腎上腺髓質(zhì)功能增強(qiáng)表現(xiàn),以及cAMP升高,6kPGF1α/TXB2比例下降等三項(xiàng)主要指標(biāo)的改變,與臨床上相一致。按各自的試劑盒說明書進(jìn)行。cAMP用液體閃爍計(jì)數(shù)器測定,TXB2、6kPGF1α和AⅡ采用γ放免計(jì)數(shù)器測放射性計(jì)數(shù)(cpm)值。TMN含量用紫外分光光度法,NE測定根據(jù)shellenberger等方法。

2.2.9方藥測證選用臨床用于治療肝陽上亢型高血壓的天麻鉤藤飲進(jìn)行驗(yàn)證。

【參考文獻(xiàn)】

[1]黃文權(quán),肖鴻,袁林貴.肝陽上亢型實(shí)驗(yàn)動物模型研究初探[J].中國中醫(yī)急癥,1996,5(1):3637.

[2]肖純.雙腎雙夾加灌附子湯復(fù)制高血壓肝陽上亢證大鼠模型[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2000,10(9):2022,25.

[3]鄢東紅.自發(fā)性高血壓大鼠肝陽上亢證模型的復(fù)制[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1999,19(4):3538.

[4]何綱,李桂英,劉新波.一種高血壓腦出血肝陽上亢證大鼠模型的建立及其評價[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2005,12(4):218222.

[5]ChungKK,MartinezM,HerbertJ.cfosexpression,behavioral,endocrineandautonomicresponsestoacutesocialstressinmaleratsafterchronicrestraint:modulationbyserotonin[J].Neuroscience,2000,95(2):453463.

[6]包天桐.應(yīng)激致“腎虛”動物模型介紹[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1998,33(9):717718.

[7]喬明琦,張惠云,陳雨振,等.肝郁證動物模型研究的理論思考[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),1997,12(5):298300.

[8]王欽茂,李莉,趙勇,等.清化膠囊對三種因素復(fù)合制造大鼠高血壓肝陽上亢證模型的治療作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2002,8(3):1417.

[9]徐叔云,卞如濂,陳修,等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:815.

[10]陳華德,方針,王翀敏.耳尖放血治療高血壓病肝陽上亢證療效觀察[J].中國針灸,2004,24(4):229231.

[11]陳國林,潘其民,趙玉秋,等.中醫(yī)肝病證候臨床辨證標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),1990,5(1):6670,73.

[12]夏大勝,尤勁松,胡隨瑜.原發(fā)性高血壓肝陽上亢證、肝腎陰虛證患者動態(tài)血壓分析[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),20