球孢白僵菌對斜紋夜蛾2齡幼蟲高毒力菌株的篩選

斜形夜蟲屬于lepidoptera夜蟲科noctuda，屬于鱗狀頭皮屑科。這是一種嚴重的農業害蟲，具有分布廣泛、食物廣泛、繁殖強烈、并發癥快等特點。有時可造成田間農作物減產26%～100%,其所為害的植物多達112種以上。近年來,我國農業種植結構不斷調整,經濟作物種植面積不斷擴大,加之受氣候等條件因素的影響,斜紋夜蛾的危害愈加嚴重,已由過去的間歇性、偶發性、次要性害蟲迅速上升為常發性、暴發性的農業大害蟲。對農業生產、園林綠化等都造成了嚴重的損失。目前,對于斜紋夜蛾的防治主要依賴于化學農藥,然而長期、連續的不加區別的濫用各類化學殺蟲劑,已經使得斜紋夜蛾對諸多殺蟲劑的活性成分產生不同程度的抗性,甚至產生了同時對多種藥物的交叉抗性,從而使得田間防治愈加困難。同時,化學農藥毒性高、殘留量大,對人們的健康以及環境都存在較大威脅。因此,積極尋找高效低毒的替代方法對斜紋夜蛾進行防治是目前無公害蔬菜生產上亟需解決的問題。球孢白僵菌Beauveriabassiana作為一種重要的昆蟲病原真菌,以其高效、低毒、不污染環境、對人畜無害等特點長期以來受到了廣泛的關注和深入的研究,其對鞘翅目、同翅目、鱗翅目以及螨類等諸多害蟲的田間防治也都取得了滿意的效果,并且已有多種劑型產品在歐美國家登記注冊,用于多種農林害蟲的微生物防治。球孢白僵菌主要通過體壁侵染的方式感染宿主,它的侵染體有分生孢子、芽生孢子和菌絲體3種形式。其中,分生孢子是最常見的侵染體,被加工成多種劑型。傳統上,球孢白僵菌多采用粉劑,但由于粉劑在運輸、貯存和使用上的不便以及田間施用后的附著力較差、菌粉用量大、防治效果不穩定等因素,近些年來,將分生孢子制成油劑或懸乳劑逐漸成為研究熱點。油劑是指將分生孢子粉按一定比例兌入載體油中并輔以多種助劑而制成的一種制劑,一般通過超低容量噴霧使用,具有粘著力強和滲透性好的特點,可以破壞蟲體表面蠟質層和幾丁質,從而有利于菌體芽管的侵入。與傳統水質懸浮劑相比更具有傳染力。由于油劑具有良好的分散性和附著性,其對寄主的效果都會得到提高。同時,其理化性質穩定,有助于孢子粉在常溫下的貯存。而且,可以向油劑中加入具有與分生孢子粉生物相容性的乳化劑,從而可以用水將其稀釋為不同濃度的孢子水懸乳液,用于常規容量的噴霧。本研究在立足于本實驗室對球孢白僵菌劑型化相關研究的基礎上,室內及室外以斜紋夜蛾作為靶標害蟲,進行毒力及藥效試驗,以期尋找到可持續的、高效低毒、可替代的斜紋夜蛾防治方法。1材料和方法1.1白治療氟啶哌抑保鹽的制備供試的12株菌株除Bb0201外,均來自于美國農業部生防菌種庫ARSEF(USDA-ARSCollectionofEntomopathogenicFungalCultures,Ithaca,NY)。菌種以干燥分生孢子粉和滅菌白沙混合的形式保存于-75℃超低溫冰箱中。Bb0201由本實驗室從采自中國東北的亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis蟲尸上分離獲得。各菌株的代碼(數字為ARSEFaccessionnumber)、原始寄主(括號內給出所屬科目,種名列于括號前)及地理來源列于表1。生產白僵菌分生孢子粉時,先將保藏的菌種在薩氏培養基SDAY(葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母粉1%和瓊脂2%)平板上于25℃及12L∶12D光周期的條件下活化培養7d左右,然后將各供試菌株活化菌落中的孢子粉接入薩氏培養液SDB(不含瓊脂的SDAY培養基)中,在25℃、130r·min-1條件下培養48h,培養所得菌液轉接入新鮮SDB培養液,繼續培養24h。將所獲含有大量菌絲的菌液按1∶10的比例接到經蒸汽濕熱滅菌至適當熟度的稻米上,充分混合后,平攤于直徑15cm的培養皿中(50g·皿-1)。在25℃、12L∶12D光周期條件下固體發酵產孢7～9d。然后將發酵物料置于32℃下鼓風干燥48h,用200目標準篩機械振動收集孢子粉。然后用12LS型冷凍干燥機(VirTisCompany,NewYork,USA)在常溫真空條件下將孢子粉干燥24h后,于4℃下冷藏備用。所獲孢子粉含孢量可達1.2×1011孢子·g-1,含水量不超過5%,活孢率可達95%左右。氟啶脲(抑太保)原藥粉劑為江蘇省揚州市南通科林化學品有限公司產品,由浙江省化工研究院饋贈,用于室內生測試驗。田間試驗所用5%抑太保乳油(chlorfluazuron)為日本石原產業株式會社生產的商品制劑。1.2白僵尸菌對傾斜率為2年的幼蟲進行了內部分析1.2.1成蟲的采集:斜紋夜蛛、土石片、平床斜紋夜蛾卵取自浙江省化工研究院生測中心。卵塊經室內25℃孵化后,于塑料養蟲盒(30cm×20cm×10cm)內飼養。每天清理養蟲盒,更換新鮮的甘藍葉。待幼蟲開始化蛹時,將其轉移至盛有沙土的小桶內,使其入土化蛹。經過10～15d的蛹期,將斜紋夜蛾成蟲收集于干凈的養蟲盒內,里面放入稍加折疊的紙片,以便成蟲在紙片上產卵。將盛有5%蔗糖溶液浸泡過的海綿的玻璃平皿放在養蟲盒內,以供成蟲取食。每天檢查,將產有卵塊的紙片收集于直徑15cm的平皿內。置于25℃恒溫培養箱使其孵化,每天檢查,將同一天孵出的幼蟲轉移至另一平皿內,喂以新鮮甘藍葉片,待其蛻1次皮后,即可用于生測試驗。1.2.2重組菌的誘導誘導將斜紋夜蛾2齡幼蟲移至直徑9cm的平皿內(27～33頭·皿-1)待用。用0.02%Tween-80的無菌水溶液將各菌株的孢子粉配制為1×108孢子·mL-1的懸液,以0.02%Tween-80水懸液作為對照。采用標準噴塔法接種。接種時,將盛有幼蟲的平皿置于全自動噴塔(PotterSprayTower,BurkardScientificLtd.,Middx,UK)直徑11cm的底部載物臺上,每次吸取1mL孢子懸液注入噴塔頂端的噴嘴中,于0.7～0.8kg·cm-2的壓力下噴霧到底部載物臺盛有幼蟲的平皿上。噴霧后,將幼蟲轉移至另一直徑9cm的平皿內,每天喂以新鮮甘藍葉并以保鮮膜封住平皿口,置于溫度25℃、光周期12L∶12D的培養箱中飼養,逐日觀察幼蟲的死亡情況。及時挑出死亡幼蟲,在25℃下保濕培養,觀察是否有接種真菌的長出物以確定是有效感病死亡。各菌株的實際接種劑量用平放在平皿內的蓋玻片(20mm×20mm)收集噴霧后沉降的孢子,然后用棉蘭染色,在400×顯微鏡下5點取樣鏡檢(0.2165mm2·視野-1)孢子數,從而將沉降到幼蟲體表上的孢子數標準化為孢子·mm-2。每個菌株處理重復3次。1.2.3白治療條件優化方法生測試驗根據1.2.2的篩選結果,選取其中毒力最高的1株進行后續試驗。共設5個生物測定試驗:(1)生測1是將供試菌株的孢子粉用0.02%Tween-80水溶液分別配制為1×108、1×107、1×106孢子·mL-1的孢子懸液。以0.02%Tween-80水溶液作為對照,采用標準噴塔法,按照從對照、低濃度至高濃度的順序各噴霧1mL。實際孢子接種量的確定以及幼蟲的觀察記錄方法均與1.2.2中相同。(2)生測2和生測3為油劑生測試驗。將孢子粉分別兌入純礦物油(液體石蠟)和含10%凡士林(v/v)的礦物油中,配制成含孢量為1×1010孢子·mL-1的油劑(分別記為油劑Ⅰ和油劑Ⅱ)。將10%的乳化劑AEO-3分別加入到油劑Ⅰ和油劑Ⅱ中,混勻;再分別用清水進行100、500和1000倍稀釋,以不含孢子粉的對應油劑的100倍稀釋液為空白對照;按生測1的方法接種和觀測。(3)生測4是抑太保對照試驗。將抑太保原藥粉劑與液體石蠟混合,配成含量為5%有效成分(即含5%氟啶脲)的油劑。將甘藍葉剪成直徑8cm的圓形葉片,置于噴塔的載物臺上。將10%的乳化劑AEO-3加入到含藥油劑中,混勻,用清水1000倍稀釋后,按田間常規推薦用量700mL·hm-2,噴霧到載物臺的葉片上,葉片正反兩面均需噴霧。將上述稀釋液分別進行5倍(Ch0.2)和10倍(Ch0.1)稀釋,按相同方法進行噴霧(分別相當于1/5和1/10常規推薦用量)。將噴過藥的葉片置于通風櫥,吹干上面的水滴,再分別放入直徑9cm平皿中,往每個平皿中挑入30～33頭斜紋夜蛾2齡幼蟲。每1～2d更換葉片,所換葉片用上述相同方法處理。按與生測1相同的方法逐日檢查幼蟲的死亡情況。(4)生測5是菌藥協同作用試驗。幼蟲按生測3的方法進行白僵菌制劑的接種,所喂葉片則按生測4的方法用1/10常規推薦用量的藥劑處理。逐日檢查幼蟲的死亡情況并及時挑出蟲尸,25℃下保濕培養,觀察體表長出物,以確定是否為真菌感染死亡。5個生物測定試驗在3個月內完成。1.3驗證空間1.3.1產孢子粉的制備田間試驗中,采用的孢子粉為1.2.2中篩選的高毒力菌株。由于用量較大。孢子粉的生產采用本實驗室自行研制設計的一種專門用于規模化生產孢子粉的新式發酵裝置,立式多層產孢培養箱,仍以適度熟化的低值稻米作為主要產孢基質。產孢培養結束后,用進口孢子分離器“MH-1”(CABIBioscience,SilwoodPark,Ascot,Berks,UK)收獲孢子粉,然后用12LS型冷凍干燥機(VirTisCompany,NewYork,USA)在常溫真空條件下將孢子粉抽干24h。然后將孢子粉按100～150g·L-1的比例與含有10%(v/v)醫用凡士林的液體石蠟油混合均勻,即制成試驗所需的真菌孢子油劑。此油劑中孢子粉含量可達到1.0×1010～1.2×1010孢子·mL-1,孢子活孢率均在95%左右。1.3.2保乳劑、水劑、儀器在浙江省寧安徽省馬鞍山市雨山區佳山鄉湯陽村選取1塊花椰菜田進行獨立的田間藥效試驗。試驗時間為2009年9月17-26日。試驗期間的水肥等均按常規管理但未施用任何殺蟲劑,花椰菜處于生長中期,田間斜紋夜蛾主要為2～3齡幼蟲。于2009年9月17日傍晚進行噴霧。試驗共設5個處理:Ⅰ、純菌劑處理(以Bb表示);Ⅱ、5%抑太保乳油的1/10常規推薦用量處理(Ch0.1);Ⅲ、5%抑太保乳油常規推薦用量處理(Ch);Ⅳ、菌藥混用處理(Bb+Ch0.1),即純菌劑與1/10常規推薦用量的5%抑太保乳油混用;Ⅴ、清水對照(C)。菌劑處理的實際用菌量按油劑1.5L·hm-2,即理論上相當于1.5×1013～1.8×1013孢子·hm-2,2個抑太保處理的實際用量分別按乳油750mL·hm-2和乳油75mL·hm-2,即分別相當于常規推薦用量和常規推薦用量的1/10。各處理(除對照外)的藥劑在使用前,先加入8%乳化劑AEO-3,混合均勻,然后均用清水500倍稀釋,采用背負式手動噴霧器(WS-16型,山東衛士植保機械有限公司生產)在0.2～0.4MPa的工作壓力下手動噴霧。每處理小區重復4次,每個小區面積為15m2,各處理小區隨機區組分布。1.3.3田間調查及氣象監測田間葉面孢子沉降量:為了估計各用菌處理噴霧后孢子在花椰菜葉上的沉降量,在用藥噴霧前,先在用菌處理和菌藥混用處理的各小區內用雙面膠隨機固定放置5張載玻片(2.5cm×7.5cm)于植株葉片上,噴霧后,收集載玻片,玻片中央用棉藍染色后以蓋玻片固定。將玻片帶回室內,于400×顯微鏡下隨機選取5個視野(0.2165mm2·視野-1)計數,確定真菌孢子的沉降量(孢子·mm-2)。田間蟲口調查:施藥前調查各小區蟲口基數,施藥后分別在第3、6、9d各調查1次蟲口情況。采用每小區對角線5點取樣法定點調查,每點查1株,調查整個植株上的幼蟲數。田間氣候條件監測:田間試驗期間,將1個小型ZDR-20溫濕度記錄儀(浙江大學電氣設備廠生產)隨機放在試驗田的1棵花椰菜植株下,設定為每2h自動記錄1次田間的溫度和相對濕度。降雨量由當地氣象觀察站獲得。這些記錄用于說明試驗期間的田間條件。1.4蟲口消失率及相對防效對高毒力菌株篩選的試驗結果進行機值分析,以獲得各菌株與致死率以及半致死時間(LT50)之間的關系。在不同制劑的室內生測試驗中,按時間-劑量-死亡率模型進行分析,并計算出相應的半致死劑量(LC50)和半致死時間(LT50)。根據田間調查所得蟲口變化情況,計算出蟲口減退率及相對防效并進行兩因素隨機區組方差分析。蟲口減退率D及相對防效E用如下公式計算:D=(dT0-dTi)/dT0×100%,E=(1-dCK0dTi/dCKidT0)×100%。式中,dT0和dTi分別表示小區在處理前和處理后第id的蟲口密度,dCK0和dCKi分別表示清水對照小區噴霧前后的蟲口密度。所有分析均采用DPS計算機軟件完成。2結果與分析2.1不同菌株對斜紋夜蝶毒力檢測效果的比較各菌株接種時所用各菌株的孢子懸液都配制成相同濃度,即1×108孢子·mL-1的孢子懸液,生測結果見圖1。噴霧接種后,12株供試球孢白僵菌沉降在斜紋夜蛾2齡幼蟲體表上的平均孢子數約為2500孢子·mm-2。各菌株平均接種斜紋夜蛾2齡幼蟲90(87～97)頭,空白對照的幼蟲在第7d的平均自然死亡率為11.1%(10.0%～13.3%)。各接菌處理在第7d的累計校正死亡率為33.92%～82.43%。不同菌株之間差異顯著(F11,22=23.85,P<0.01),但在同種菌處理的各重復之間無顯著差異(F2,22=0.46,P=0.64)。其中,造成斜紋夜蛾2齡幼蟲死亡率最低的菌株為Bb2336和Bb4535,分別為33.92%和33.93%,Bb2860導致供試幼蟲累計死亡率最高,為82.43%。此外,生測中的蟲尸在保濕培養下,絕大部分的表面均在1～3d內長出菌絲,并可觀察到白僵菌產孢結構。除Bb4535和Bb2336外,其余10株供試球孢白僵菌高劑量接種對斜紋夜蛾2齡幼蟲的毒力均能計算出半致死時間LT50的估計值(圖1)。這些菌株對斜紋夜蛾的平均LT50為4.41d,其中最短為Bb2860的3.91(95%CI:3.59～4.26)d,最長為Bb4580的5.38(95%CI:4.94～5.87)d。雖然Bb0201和Bb2879導致試蟲7d校正死亡率相對較低,但其致死試蟲的速度相對較快,表現為LT50較短,其估計值及其95%置信區間分別為3.94(3.46～4.48)d和4.08(3.76～4.42)d。而Bb156+159和Bb734在導致試蟲較低死亡率的同時也擁有較慢的殺蟲速度,其LT50估計值及其95%置信區間分別為4.78(3.84～5.96)d和4.99(4.45～5.61)d。2.2不同接種方式對斜紋夜訴訟幼蟲的效果球孢白僵菌Bb2860的不同制劑在高、中、低3個劑量下接種斜紋夜蛾2齡幼蟲后的累積死亡率隨時間和劑量的變化趨勢如圖2所示。在各用菌的生測處理中,低、中、高3個劑量的孢子沉降量分別為90(65～122)、447(319～529)、1292(907～1561)孢子·mm-2,根據兩因素方差分析,孢子沉降量在不同劑量間差異極顯著(F2,22=4256,P<0.01);同時,不同制劑間孢子沉降量差異也極顯著(F3,22=32.15,P<0.01)。在各生測觀察中,斜紋夜蛾2齡幼蟲一般在噴霧后2～3d開始死亡,至6～7d時累積死亡率趨于穩定。幼蟲的死亡率明顯隨著各制劑接種孢子劑量以及抑太保用量的增加而呈現出增高的趨勢。各處理的空白對照中,幼蟲死亡率始終保持在低自然死亡率水平。接種后第7d,各生測對照中的幼蟲死亡率平均為1.86%(0.97%～3.10%)。在高劑量下,各處理引起的幼蟲死亡率為81.1%～100%;中劑量下為44.2%～86.8%;低劑量下為24.7%～62.2%,各處理間差異顯著(F4,28=17.1,P<0.01)。此外,幼蟲的死亡率在同一處理的不同劑量間也差異顯著(F2,28=115.6,P<0.01)。在死亡的幼蟲中,僅空白對照和純藥劑處理的蟲尸體表未出現供試菌的典型癥狀,其它各用菌處理的蟲尸絕大部分均長出菌絲。將球孢白僵菌不同制劑中用菌處理所得的各組生測數據按時間-劑量-死亡率模型進行數據分析。根據模型模擬分析結果計算得到各個生測處理在不同接種濃度下對斜紋夜蛾2齡幼蟲的LC50和LT50(圖3)。在各生測處理中,LC50值均隨接種時間的延長而下降。如生測1和生測5在接種后第2d的LC50值(lg對數轉換值)分別為4.97和3.76,第7d分別為2.56和2.06。隨著孢子接種劑量的增加,LT50值逐漸減小。各生測的LT50曲線呈現從高到近的漸進收斂趨勢。在500孢子·mm-2的劑量下,生測1、生測2、生測3、生測5的LT50分別為5.8、4.6、4.0和3.5d。在相同的LT50條件下,從生測1～3及生測5的所需孢子接種濃度依次減小。圖3的LC50及LT50的變化趨勢表明,將白僵菌孢子油劑化后,對斜紋夜蛾2齡幼蟲具有增效的趨勢。而且,抑太保對油劑化后的制劑具有進一步的協同增效作用。2.3農村地區的再造林效果2.3.1各處理種子沉降量對試驗中含有菌劑的2種處理在花椰菜葉片上的孢子實際附著量的估計基于放在各處理小區內的5張載玻片。顯微鏡檢獲得單獨用菌處理以及菌藥混用處理的區塊上平均孢子沉降量分別為451.0孢子·mm-2和458.9孢子·mm-2。試驗中純菌劑和菌藥混用的2個處理的田間孢子沉降量無顯著差異(F1,28=0.58,P=0.45),而且同一處理的各區塊間的孢子沉降量也無顯著差異(F3,28=2.21,P=0.11)。表明施用真菌孢子懸乳劑所得到的孢子用量在田間的分布是比較均一的。2.3.2菌株-1的合成在噴藥前進行蟲口基數的調查,5種處理的初始蟲口密度分別為15.00、10.25、12.75、13.00和15.50頭·5株-1。用DPS數據處理系統進行單因素隨機區組方差分析,初始蟲口密度在各處理間(F4,12=0.47,P=0.76)以及各區組間(F3,12=0.16,P=0.92)的差異均不顯著。2.3.3日最低氣溫和日最低氣溫本試驗開始于9月中旬,田間溫濕度記錄表明(圖4下),試驗期間的田間日平均溫度為23.7℃(22.1～24.9℃),其中日最低氣溫為21.8℃,日最高氣溫為26.8℃;日平均相對濕度為93.3%(83.6%～97.0%),相對濕度≥90%的記錄為194h,期間總降雨量為8mm(分別在第3、6、9d有零星小雨,雨量均≤3mm)。2.3.4不同保險劑用量及對斜紋夜蛛蟲口減免率的相對防效在上述田間小氣候條件下,定期抽樣調查田間各處理區塊內的蟲口密度(圖4上),再根據蟲口密度計算出蟲口減退率和相對防效(表2)。施藥以后,對照區塊的蟲口密度一直呈上升趨勢,到第9d蟲口增加了近3.5倍,蟲口減退率為-343.83%。常規用量的抑太保及菌藥混用這2種處理區塊內的蟲口密度均有明顯下降,第3d的蟲口減退率分別為94.03%和91.11%;第6d的蟲口減退率分別為93.87%和94.08%;到第9d蟲口密度有所反彈,蟲口減退率分別為54.40%和61.06%。純菌劑處理區在第3d的蟲口減退率為84.62%;在第6d蟲口就有所反彈,蟲口減退率為68.40%;到第9d蟲口密度反彈到與初始蟲口密度相當,蟲口減退率為3.26%。低劑量抑太保處理區的蟲口密度在前6d則沒有顯著變化,均與初始蟲口密度相近,第3d蟲口減退率為12.73%,第6d蟲口減退率為-3.25%;到第9d則有較大反彈,蟲口減退率為-121.66%。對于各處理的相對防效,藥后3d,對斜紋夜蛾的防效以常規用量抑太保作用最好,相對防效達96.72%。菌藥混用和純菌劑的相對防效分別為95.23%和91.60%。低劑量抑太保的相對防效為52.39%。藥后6d,菌藥混用和常規用量抑太保處理區的相對防效均幾乎沒有變化,分別為97.96%和97.85%。而球孢白僵菌菌劑相對防效有所降低,為88.84%,低劑量抑太保處理區此時的相對防效為64.16%。藥后9d,各處理區的蟲口均有所反彈,菌藥混用和常規用量抑太保處理區的相對防效分別為91.13%和89.70%,純菌劑處理區的相對防效降為77.64%。而低劑量抑太保的相對防效僅為49.02%。兩因素隨機區組方差分析表明,相對防效在不同處理間差異極顯著(F3,9=162.6,P<0.01),在不同的調查時間差異也極顯著(F3,9=1415.2,P<0.01),但各處理的每區組之間差異不顯著(F3,9=1.13,P=0.35)。3球孢白定量制劑防治斜紋夜手術的效果球孢白僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌,并廣泛應用于農林害蟲的生物防治。本研究的室內生測結果表明,供試12株球孢白僵菌菌株對斜紋夜蛾2齡幼蟲均具有不同程度的侵染致病能力,但菌種之間差異較大。菌株Bb2860在接種后第7d斜紋夜蛾幼蟲的校正死亡率最高,因此被選為防治斜紋夜蛾有應用潛力的高毒力菌株。在不同制劑的室內生測試驗中,油劑Ⅰ所得的死亡率優于吐溫水孢子懸液,而油劑Ⅱ則優于油劑Ⅰ。菌藥混用與油劑Ⅱ相當。試驗表明,與孢子水懸液相比,將真菌孢子油劑劑型化后,可以提高它對斜紋夜蛾2齡幼蟲的毒力效果。同時,在油劑中加入一定量的穩定劑,可以提高油劑粘度,增加油劑中孢子的懸浮穩定性,減慢孢子粉的沉降,對油劑藥效亦有促進作用。油劑Ⅱ與低劑量的抑太保協同使用時,則進一步提高了殺蟲速度。在田間試驗中,球孢白僵菌制劑也顯示出良好的田間防治斜紋夜蛾的效果。尤其以純菌劑與低劑