鋼板和矩形髓內釘固定對兔脛腓骨骨折成骨細胞內骨形態生成蛋白的影響

矩形髓內釘屬于可屈髓內釘系列，主要用于脛骨脛骨骨折的內固定，也可用于股關節外側骨折。該釘療效優良,且具良好的力學優勢。本試驗對矩形髓內釘內固定后對脛骨骨折愈合成骨細胞內骨形態生成蛋白(BMP)含量的影響進行研究。探討可屈性髓內釘固定與堅強接骨板固定后骨折愈合的不同過程及其機制。1材料和方法1.1動物健康新西蘭兔24只,體重1.8～2.2kg,購自第二軍醫大學實驗動物中心。1.2試驗用植物葉片聚丁酯part-peroxidase-cohirt2me(1)一抗:BMP-Ab購自第四軍醫大學口腔醫學院病理科。工作濃度1:100。(2)二抗:IgG。(3)三抗:Streptoavidin-peroxidase-conjugate,均為Wak醫學化學公司產品。(4)過氧化氫酶阻斷劑,DAKO公司產品,由長海醫院病理科免疫室提供。(5)10%正常羊血清,為Wak醫學化學公司產品。(6)0.01mol/LPBS。1.3像分析處理系統(1)30mAX線攝片機。(2)IMS圖像分析處理系統。(3)兔脛骨矩形髓內釘(上海鋼研所訂制)。(4)4孔鋼板,上海浦衛醫療器械廠生產。(5)Leitz恒冷箱冰凍切片機。1.4鋼板內固定組動物1%戊巴比妥鈉麻醉后,仰臥位,無菌條件下,鋪巾,取雙膝中段前外側切口,線鋸造成骨折。左膝下0.3cm,脛前兩側倒“八”字切口,暴露上段脛骨,各打入矩形髓內釘1根(矩形髓內釘組),右脛骨骨折處用鋼板內固定(鋼板組),逐層縫合傷口。術前術后常規80萬u青霉素肌注,預防感染。1.5雙側軟骨骨髓內固定內固定后14、21、28d分三批處死后立即取雙側脛骨骨痂標本-80℃冰箱中保存。固定,10%中性緩沖甲醛固定保存8h,沖洗后,石蠟包埋。1.6切常溫下Leitz切片機連續切片,切片厚6μm。1.7免疫染色采用金巖等檢測BMP方法。將切片經計算機圖像分析系統處理,數據用未配對資料t檢驗。2細胞平均積分光密度細胞染色中出現棕色為陽性反應,每次染色均作對照,用PBS代替BMP-Ab,其結果為陰性。將免疫組化片經圖像處理系統,分別于每個標本中手選10個細胞,用密度積分法算出每個細胞平均積分光密度,代表該標本中單個細胞BMP含量。(結果見圖1～3),用配對資料t檢驗處理數據,結果14、21、28d時,組間比較均有顯著差異(P<0.05)。矩形髓內釘組骨痂中成骨細胞內BMP含量高于鋼板組。3討論3.1內固定方法的選擇骨折愈合的力學環境受很多因素影響,包括骨折類型、復位情況、內固定或外固定條件、患者活動情況等。從生物力學特點及內固定后對骨折愈合的影響來看,骨折內固定主要可分為兩類,一類以加壓鋼板為代表的堅強的內固定,它們以解剖復位和骨折段間絕對穩定為目的,堅強內固定后骨折以一期愈合方式愈合,無骨痂形成;另一類以Ender釘為代表的彈性內固定,并不強調骨折段間絕對穩定,而以維持對線、對位為目的,允許折段間微動,骨折以二期愈合方式愈合。3.2骨髓炎的形成因素骨痂含量與骨折斷端間活動有關。Danis首先觀察到骨折1期愈合,即皮質骨放射學上未見骨痂的愈合。Willenegger研究表明只有在絕對穩定下骨折以這種方式愈合,如達不到絕對穩定,骨折以二期愈合方式進行,即以骨痂形成方式愈合。臨床和實驗表明,接骨板剛度越高,骨折愈合時外骨痂越少。骨痂形成可能與以下因素有關:(1)骨折后兩骨折端互相接觸,互相誘導才能使骨折愈合,如果縫隙太大,則必然發生骨不連;(2)Fukzda和Yaisnda發現骨的壓電現象。并認為壓電會影響細胞活動及骨愈合,骨代謝;(3)骨折周圍會出現大量介質或因子,如炎癥介質,骨形態生成蛋白(BMP),轉化生長因子(TGF-β)等,這些物質的產生或數量影響骨折愈合。近年來研究表明骨折斷端間微動能刺激骨痂生長,促進骨折愈合。BMP分泌可能受多種因素的影響,本實驗至少部分提示不同固定方式也是其中的一種影響因子,應力與BMP分泌更明確的關系則需要嚴格的離體實驗來證實。有待于進一步研究。3.3圖像細胞分析術本實驗所用的計算機圖像分析系統為WDL-Ⅰ型癌細胞DNA分析系統加用免疫組化定量分析專用軟件構成,是一種以圖像分析方法來測量細胞內物質含量的新技術,稱為圖像細胞分析術(Imagecytometry,ICM)。按Lambert-Beer定律,吸收光正比于物質的含量,物質的含量越大,吸收光愈多,光的透射率愈低。這種ICM技術出現后受到國外病理學界普遍地重視,認為是顯微分光光度儀的替代產品,并能與流式細胞分析術相媲美。ICM具有方法簡便、實用而且準確性高等特點。本實驗圖像分析采用波長為560nm,免疫組化定量為相對定量,選用同一標準,因而具有可比性。3.4bmp的表達研究表明,骨折愈合過程中,自血腫內第3d即可檢測到BMP分泌,且14d時骨痂中BMP最為豐富。這與本實驗結果相似。14d以后,陽性著色的細胞逐漸減少,且細胞內著色的BMP平均積分光密度值逐漸減少,表明BMP分泌具有時象性。Andrew等在骨折后10d的骨痂中觀察到成骨細胞、早期成軟骨細胞中有BMP2mRNA表達。10d以前的標本中。沒有BMP2mRNA表達,至骨改建期,BMP2表達減少。影響BMP分泌的因素較多,如骨折部位,骨折段血供及軟組織損傷情況等。比較肯定的因素還包括其它生長因子的作用和骨折段間的