銀杏葉提取物egb61對廢用性骨骼肌萎縮的防治作用

0ebc7-1對小鼠骨骼肌損傷的防護作用四肢運動是關節疾病的主要治療方法。骨肉肌肉的消耗性萎縮嚴重影響了疾病的治療和功能恢復。在某些情況下，這種有害程度超過原發病。骨肉肌肉萎縮已成為患者恢復四肢功能的重要障礙。如何有效管理它尤為重要。在本研究中，我們將重點放在銀杏葉提取物egb761對下肢收縮后腓腸肌肌腱張力、肌肉水分重量、蛋白質含量、na-k-apollov多樣性和ca2-apollov多樣性的影響上，并研究了對骨肉肌腱肌腱葉片狹窄的保護效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物和組成雄性SD大鼠24只,體質量200~260g,由南方醫科大學試驗動物中心提供,隨機分為空白組,對照組,試驗組,每組8只.1.1.2試劑與檢測試劑盒銀杏葉提取物EGB761購自浙江康恩貝制藥股份有限公司,考馬斯亮蘭蛋白檢測試劑盒、ATP酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,PCLab生物信號采集處理系統(VER2.2.0)操作程序由北京微信斯達科技發展有限責任公司提供.1.2方法1.2.1銀杏葉提取物的制備空白組進行籠內自由活動,對照組及試驗組大鼠按文獻方法,將大鼠右后肢用可塑性石膏由足跖管型固定至膝上1cm處,膝關節固定于屈曲位100°,踝關節固定于跖屈60°,以便小腿的肌肉保持于松弛位,共4wk.每日檢查固定情況,隨時進行調整.石膏浸液摻入苦味酸,以防大鼠啃咬.對照組每天給予蒸餾水3mL灌胃,試驗組每天給予銀杏葉提取物EGB761水溶液(14g/L)灌胃(120mg/kg).1.2.2小鼠小鼠腓腸肌收縮張力,小鼠骨神經功能檢測4wk后,20g/L戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉大鼠,完整解剖右后肢腓腸肌,坐骨神經,進行腓腸肌收縮張力檢測.然后切取腓腸肌,去除腱膜、肌腱和神經,進行濕重、蛋白含量及酶活性檢測.1.2.3坐骨神經的發育預先運行PCLab生物信號采集處理系統,將動物牢固固定于實驗臺上.取右后肢下段背側切口,切開皮膚分離出腓腸肌,于近端分離解剖出坐骨神經,遠端從肌腱止點處剪斷.用絲線將其與機械-電換能器連接,使肌肉處于最適初長度.經預實驗得知當張力為50g時,肌肉處于最適初長度.鉑金絲電極置于坐骨神經表面.經預實驗設置單收縮刺激強度為3V,波寬1ms,強直刺激幅度3V,波寬1ms,串長2s,首頻率50Hz.頻率增量50Hz.電腦可直接記錄收縮曲線和測量結果.1.2.4測量的肌肉骨骼的重量將腓腸肌由起點至止點完整的切下,除去肌肉上附著的組織后,在電子天平上稱其質量.1.2.5小鼠腓腸肌組織蛋白的測定采用考馬斯亮藍法測定肌肉總蛋白含量:用牛血清蛋白制備標準曲線.取各組腓腸肌組織,按肌肉∶水=1∶9(V/V)的比例加入生理鹽水,用勻漿儀制成20g/L肌肉勻漿.按試劑盒要求步驟加入考馬斯亮藍染液,靜置后在分光光度計上于波長595nm處比色.對照標準曲線求得蛋白含量.1.2.6肌肉酶活性測定Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性的檢測程序按照ATP酶測試盒說明書提供的方法進行.先將每份肌肉標本分別稱重,按肌肉∶水=1∶9(V/V)的比例在每份標本中加入生理鹽水,將肌肉剪碎,在玻璃勻漿管中制成100g/L的勻漿,3000r/min離心10min,取上清0.2mL加入0.8mL生理鹽水稀釋成20g/L的勻漿.勻漿中加入酶促反應的相應試劑,混勻后,4000r/min離心10min,取上清200μL定磷.加入定磷試劑后混勻,37℃水浴30min,冷卻至室溫,在分光光度計660nm處(1cm光徑,蒸餾水調零)比色,讀數.與標準無機磷酸成色進行比較,酶活性以無機磷(pi)μmol/(mg·h)表示.統計學處理:用SPSS10.0軟件采用One-WayANOVA法,各組間兩兩比較用LSD法.2結果2.1單次收縮張力試驗對照組、試驗組與空白組相比,腓腸肌單次收縮最大張力、強直收縮最大張力顯著性下降(均P<0.05).試驗組的單次收縮最大張力、強直收縮最大張力顯著優于對照組(均P<0.05,表1).2.2兩組肌濕重、蛋白質含量的對比對照組、試驗組與空白組相比,腓腸肌濕重、蛋白質含量顯著性下降(均P<0.05).試驗組的肌濕重、蛋白質含量顯著優于對照組(均P<0.05,表2).2.3對腓腸肌na+-k+-atp酶及ca2+-atp酶活性的影響-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性對照組、試驗組與空白組相比,腓腸肌Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性顯著下降(均P<0.05).試驗組的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性顯著高于對照組(均P<0.05,表3).3銀杏葉提取物ebc7的活性銀杏葉提取物為來源于中藥銀杏葉的復合藥物成份,EGB761是標準銀杏葉提取物的代號(主要有效成分是黃酮類和萜類化合物,分別占24%和6%),具有多種生理活性:總黃酮苷可以直接消除體內自由基;總內酯可以通過改善骨骼肌微循環加快廢物代謝和自由基的清除.EGB761能提高細胞氧化磷酸化水平,保護Na+-K+-ATP酶活性.實驗證明EGB761能夠有效的延緩去神經支配的骨骼肌萎縮.然而,臨床上廢用性骨骼肌萎縮的發生遠遠高于去神經支配骨骼肌萎縮的發生,因此探索銀杏葉提取物對廢用性骨骼肌萎縮的防護效應意義重大.骨骼肌廢用時,蛋白分解加強、合成減少,骨骼肌總蛋白含量降低,進而引起肌質量的下降,肌纖維萎縮,造成骨骼肌的形態改變,進一步影響骨骼肌的功能.總蛋白含量降低使得收縮蛋白含量降低,進而導致收縮裝置數量減少;此外,肌纖維萎縮使得單位面積內肌纖維所占面積減少、細胞間質所占面積增加,也減少了收縮裝置的數量.從而引起整條肌肉的單次收縮與強直收縮的最大張力均發生降低.EGB761能夠抑制蛋白酶活性,使肌蛋白的分解減弱、合成加強,穩定了肌蛋白的含量,提高了骨骼肌質量,抑制了肌纖維的萎縮;同時也保持了肌纖維收縮蛋白的含量,穩定了收縮裝置的數量,進而提高骨骼肌收縮功能.肌肉運動的直接能源物質是ATP,而ATP的水解速率又決定于ATP酶活性的高低,因而,ATP酶活性是影響肌肉收縮張力和收縮功率的重要因素.骨骼肌廢用性萎縮時產生大量的自由基,Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶上均含有巰基,自由基可氧化膜上巰基蛋白和含巰基酶,使酶活性降低或喪失.本實驗結果表明,大鼠肢體固定后腓腸肌的收縮功能、濕重、蛋白質含量、ATP酶活性顯著下降,但是給予銀杏葉提取物EGB761處理的大鼠,上述指標下降程度顯著低于未經處理的大鼠,說明銀杏葉提取物EGB761能夠顯著的抑制腓腸肌廢用性萎縮.其機制可能有以下幾個方面:①直接清除自由基,提高S0D活性,減少MDA的產生;②清除過多的自由基,削弱自由基對膜蛋白的攻擊,維持C