PAGE藍色字為判斷題內容反義技術與反義藥物簡介一、定義反義技術（antisenseapproach）是根據核酸雜交原理設計,選擇性抑制特定基因表達為目的的新技術。包括反義DNA、反義RNA及核酶。反義治療的基本機制是通過阻抑從DNA到mRNA的轉錄過程或從mRNA到蛋白質的翻譯過程而阻斷細胞中蛋白質的合成。反義DNA主要指反義寡核苷酸[1]，因更具藥用價值而倍受重視。利用這一技術研制的藥物稱反義藥物。寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）是一段合成的DNA，由更小的單位即核酸組成的鏈，ODN可與基因組RNA或DNA或者基因組衍生的RNA互補。反義核酸技術發展簡史1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結構和堿基互補原則，開創了分子生物學的新紀元。1978年Zamecnik和Stephenson最先提出并嘗試使用反義技術抑制基因表達，他們用針對羅氏肉瘤病毒（RSV）RNA的反義寡核苷酸片段抑制RSV復制及其RNA翻譯獲得成功。第一次證實了反義核酸封閉基因表達的可行性。1981年Tmizawah等在大腸桿菌中發現天然存在的反義RNA，明確地將這些反義RNA定義為反義基因。由于反義技術是從生命的最根本點──核酸的角度著眼，人們預感到它將對疾病的治療有突破性進展。1990年美國的基因工程新聞把反義技術列為90年代十大熱點生物技術之一。1992－1994年，反義技術在臨床應用方面取得了重大進展，有六種反義藥物進入了二期臨床。1995年伯明翰大學的研究者首次報告了能口服的反義寡核苷酸藥物。但在1995年以前，還沒有一例關于反義核酸能降低細胞內相應靶蛋白和靶mRNA的定量資料，僅有關于推斷性的反義作用機制的報道。1996年以后，隨著對反義寡核苷酸作用機理的闡明，以及一些良好的臨床結果的報道，人們對反義療法又燃起了新的熱情。1997年《自然》雜志指出反義藥物將成為21世紀最前沿的五種治療趨勢之一。迄今為止，已有至少17種反義寡核苷酸進入臨床試驗。反義核酸技術的種類（一）反義RNA（1）反義RNA與mRNA雜交后阻斷了其與核糖體的結合。在胞核內反義RNA影響轉錄的mRNA前體的加工和轉運，因而抑制蛋白質的合成。（2）反義RNA借助了表達載體（質粒、病毒）并在細胞內轉錄產生，避免了在給藥途徑中易被核糖核酸酶（RNase）降解的缺點。（3）反義RNA在細胞內可持續表達，不存在半衰期問題。（4）由于操作的復雜性和安全性，故多不被采用。(二)核酶（1）一種具有酶催化活性的RNA。（2）核酶可催化RNA切割和RNA剪接反應。反義RNA與靶mRNA結合后，通過體內RNase的激活，使反義RNA分子與靶mRNA鏈一起分解。但核酶只催化靶mRNA的斷裂，其本身并不受損，靶mRNA分子降解后，核酶隨即解離下來，又可與其它的靶mRNA分子結合，繼續發揮催化降解作用，因而比反義RNA的封閉阻斷效率高得多。（三）反義寡核苷酸反義寡核苷酸是與含有蛋白質氨基酸序列信息的DNA或RNA鏈的某一段互補的短鏈寡核苷酸，能抑制DNA轉錄或mRNA翻譯。簡單的說就是根據核酸雜交原理設計，可以選擇性抑制特定基因表達。第二節反義寡核苷酸一、反義寡核苷酸用于臨床必須具備的條件（一）設計容易，而且多樣根據所確定的靶mRNA的序列在轉錄、翻譯過程的任何環節階段都能設計相應的AON來加以阻止。（二）合成簡單，速度快，可大量生產大規模制備、規模化生產是任何一種藥物開發的基礎，這一點對反義藥物尤為重要。幾年前反義藥物的合成價格貴得驚人，使該類藥物的臨床前一系列研究無法進行。近年來，隨著DNA大規模合成技術的開發及合成儀器的研制成功，反義藥物的成本已降低到研究及藥用可以接受的水平，從而加速了反義藥物的臨床前研究及臨床過渡。雖然反義ODN是最成熟的反義藥物，但至今尚未商品化。美國Isis制藥公司采用快速篩選法，平均每周能鑒定出2個基因靶，只需6～9個月即可研制出一個反義化合物，并用于臨床。將于近期提出Isis-2922的新藥應用(NDA)申請。如果反義技術的進展導致寡核苷酸藥物開發成功，實際上要求寡核苷酸的合成、純化、鑒定等方面也取得進展。如Isis-2302的III期實驗和商業性生產就要求批量生產數以千克計的產品。已有一些大規模合成的設備，如帕金-埃爾默公司(Perkin-Elmer)的設備,合成規模1mM。法瑪西亞公司(PharmaciaBiotech)的OligoPilotII，合成規模0.1-4mM，每批可生產15.2g純物質。OligoProcessSystem合成規模10-150mM，每批可生產450g純物質，足供大規模臨床實驗需要。該公司計劃開發的Oligomax，合成規模2M，每批可生產6-7kg純物質，年生產能力達1噸以上。現在的DNA自動合成技術已經使AON容易合成。Pharmacia公司已經研制出合成反義DNA或反義RNA的自動合成儀。（三）AODN在體內可穩定存在（在AON的設計中的穩定性中詳細介紹）（四）能進入靶細胞并保持有效濃度多種細胞系都能對AODN有效的吸收。因此AON對穿透細胞膜不成問題。AODN也可以以胞飲、內吞、受體介導等方式進入細胞。AODN發揮其反義作用，必須在細胞mRNA結合部位達到有效濃度。而AODN一般是多陰離子化合物，大多經過多種吞噬方式進入細胞發揮其反義作用。由于這是一種耗能過程，并且轉運具有飽和性，要用很高的濃度才能有細胞水平觀察到對目的基因的明顯抑制作用。AODN的外排速度很快。可用化學修飾增加保持時間。尤其硫代型保持時間最長，有具有良好的穿膜和抗核酸酶的能力，是目前較為可取的一種。不經修飾的ODN不論在體液內還是細胞中都極易被降解，不能發揮其反義作用。因而多采用經化學修飾的ODN，以減少核酸酶對ODN的降解。對ODN化學修飾的方法主要針對三方面，即堿基修飾、核糖修飾、磷酸二酯鍵修飾。堿基修飾主要為雜環修飾、5－甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤；核糖修飾主要為己糖、2ˊ－O－甲基取代核糖、環戊烷、α－構象核糖；磷酸二酯鍵修飾主要為硫代和甲基代修飾等。其中硫代寡核苷酸（phosphorothioate,PS－ODN）、混合骨架寡核苷酸（mixedbackboneoligonucleicacid,MBO）和多肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）應用廣泛，成為具有代表型的第一、二、三代ODN。（五）AON可識別并封閉作用于靶基因1.病毒類病毒是對人和動物危害極大的病原體，反義技術能特異性地抑制有害靶基因的表達。例如：人T淋巴細胞病毒、人免疫缺陷病菌毒、單純皰疹病毒、流感病毒、腦炎病毒、SV40、羅氏肉瘤病毒、乙肝病毒、牛乳頭瘤病毒和巨細胞病毒等。2.反義寡核苷酸對某些靶基因的抗增值效應（表4-1）。在體外培養細胞上已取得極大的成功，如：原癌基因c-met編碼肝細胞生長因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）受體，這是一種較強的表皮細胞有絲分裂原。因此，c-met基因產物可能與胃癌細胞的增殖或侵襲有關。與c-metmRNA互補的反義ODN可抑制癌細胞系中對HGF的應答，并且具有防止胃癌進一步發展的潛力。Bcl-2基因的過度表達可引起抗細胞凋亡作用，從而導致對化學藥物的抗性。體外實驗有力證明，與bcl-2mRNA互補的反義ODN具有下調bcl-2表達的作用。研究顯示，bcl-2反義治療可改善復發性非-Hodgkin淋巴瘤患者的病情。表4-1 反義寡核苷酸對某些靶基因的抗增殖效應靶基因細胞類型效應c-myb原代T淋巴細胞抑制增殖骨髓單核血細胞抑制血細胞生成原代大鼠平滑肌細胞抑制增殖c-met胃癌細胞抑制增殖和侵襲c-myc原代T淋巴細胞抑制殖增T細胞雜交瘤細胞抑制調亡原代人平滑肌細胞抑制增殖H-c-ras膀胱癌細胞抑制增殖HER-2/neu卵巢癌細胞抑制增殖bcr/abl慢性粒細胞性白血病細胞抑制集落形成bcl-2前B白血病細胞抑制細胞凋亡3.宿主基因類多藥耐藥基因、周期素（cyclin）、前胸腺素、T細胞受體、表皮生長因子（EGF）受體、β-球蛋白、磷脂酶A2、蛋白激酶C、白介素-1受體相關激酶等。4.細胞因子類：堿性成纖維細胞生長因子、白介素-2、白介素-1、IGF-1、粒巨噬細胞集落刺激因子、集落刺激因子-1等5.其他：氯霉素乙酰轉移酶、TAR驅動的胎盤堿性磷酸酶、人乳頭瘤病毒E2反應元件驅動的氯霉素乙酰轉移酶。二、反義寡核苷酸的設計（一）專一性反義寡核苷酸必須具有高度的選擇性，即專一性的識別DNA或RNA的特定序列并與之結合，這也是作為高效、安全的藥物的基本要求。針對同一mRNA不同序列的反義寡核苷酸的作用效率相差甚遠。所以mRNA的5’端、啟動密碼AUG周圍或核糖體裝配部位、3’端的非翻譯區域，都可成為可選擇的靶位。反義寡核苷酸可通過下述機制干擾基因的表達：（1）反義寡核苷酸與翻譯起始位點雜交。這樣可形成一種穩定的雙鏈結構，從而阻礙了與搜尋起始密碼子AUG的核糖體小亞基的結合，最終導致核糖體大亞基不能與其小亞基正確裝配及起始翻譯。在體外系統中已觀察到反義寡核苷酸對翻譯、剪接和核轉運的抑制作用，并且這種抑制作用依賴于寡核苷酸的長度及其化學組成。從理論上講，長約15個核苷酸的小寡核苷酸已具有抑制單個靶基因表達的特異性。過短則減少了其效應并增加了對細胞的非特異性抑制，過長不利于合成和修飾，同時影響進入細胞的能力。（2）反義寡核苷酸與RNA序列結合。這樣可形成RNA-DNA雙鏈，其中RNA部分可被RnaseH切割。一旦切割后，mRNA不能再進行翻譯，并且迅速降解。通過這種機制進行的抑制作用是不可逆的，但缺點是非特異性。不依賴于Rnase的抑制作用具有更強的靶特異性。（二）穩定性反義寡核苷酸能夠發揮其作用，必須滿足以下條件：充分的細胞內濃度，較長的細胞內半衰期，具有對抗血漿、體液及細胞內核酸酶降解的能力。由于未修飾的反義寡核苷酸一般會立即被降解，為增加其穩定性，人們對它進行了大量的修飾。如：(1)改變立體構型。由天然的β型糖苷鍵改為α型。如：猴腎病毒α型比β型抗酶能力提高了30倍以上，說明α型是翻譯的有力抑制劑。(2)化學修飾。即寡核苷酸磷酸骨架上的羥基被一些化學基團取代，如甲基（M）、氨基（NH）和硫(S)等，形成非離子型衍生物。由于M－和NH－ODN及α型異構體穩定性較好，也易進入細胞，但它們不能活化RNA酶H降解雜交雙鏈中的mRNA，因而需要濃度較高，效果不盡如人意。由于磷酸二酯鍵是核酶的主要靶點，因此采用硫化試劑將ODN磷酸二酯鍵硫化成為PS-ODN類結構，是增強ODN穩定性的有效途徑。PS-ODN是迄今研究最深入、應用最廣泛的一類as-ODN。作為第一代as-ODN藥物，PS-ODN具有良好的水溶性、穩定性及易于大量合成，基本能滿足臨床治療的需要。與天然ODN相比，PS-ODN通過細胞內吞作用進入細胞內平衡所需時間更長，最終細胞內濃度也更高；其t1/2一般都大于24h[2]，極大地提高了對核酸酶的耐受能力。PS-ODN抑制基因的表達通過兩種方式，即誘導RnaseH以降解目的mRNA或與目的mRNA形成雜交體而干擾mRNA的加工和翻譯。其副作用主要來自其攜帶的負電荷和免疫原性，由于PS-ODN帶有大量的負電荷，能與多種因子結合從而導致非特異效應。體外實驗表明，PS-ODN及其核酸降解物能與血清蛋白、細胞表面受體結合，或者進入細胞內與某些堿性蛋白質或酶結合[3]。另外的研究還發現，PS-ODN及其核酸降解物中含有多個連續的CpG序列，會產生非序列特異性的抑制作用[4]。（三）通透性1．與多聚離子藥物載體(PLL)連接由于PLL帶正電荷，可與細胞膜非特異結合，所以可增加反義寡核苷酸透過細胞膜的效率。2．垂環修飾如膽固醇和磷脂與反義寡核苷酸結合后，對細胞的親和力可增加8—10倍。3．脂質體包裹脂質體包裹修飾后的反義寡核苷酸不僅可以避免細胞外環境中核酸酶對其破壞作用，而且有利于通過血腦屏障，進入大腦。如：TGF、IGF就是治療腦膠質瘤的反義藥物。三、反義寡核苷酸的作用機理反義治療的基本機制是通過阻抑從DNA到mRNA的轉錄過程或從mRNA到蛋白質的翻譯過程而阻斷細胞中蛋白質的合成。轉運RNA（tRNA）就是一種反義或負鏈RNA，它可通過以下4種方式發揮作用：(1)與mRNA堿基配對，起始信息的翻譯。(2)與mRNA堿基配對，延伸信息的翻譯。(3)與rRNA堿基配對，定位三核苷酸反密碼子區，以便與mRNA密碼子產生最佳的雜交。(4)提供末端反密碼子（terminalanticodon）（一種反義三核苷酸）以終止新生蛋白質序列。通過適當的載體進行轉染以產生質粒衍生的反義mRNA可內源性地抑制翻譯。各種亞類反義寡核苷酸外源性地抑制翻譯。各種亞類反義物質如反義序列、反基因（antigene）序列和核酶可在不同位點阻斷轉錄或翻譯過程。具體來說，AON的作用機理如下：(1)物理阻斷作用于mRNA5′端非翻譯區，如核糖體結合位點，阻斷rRNA與mRNA的結合，干擾相應基因的翻譯。(2)激活核糖核酸酶H（RnaseH）反義寡核苷酸與mRNA結合，激活RNaseH，剪切雜交分子中的mRNA。(3)阻斷mRNA拼接反義核酸與前mRNA外顯子和內含子的連接區結合，抑制正常成熟mRNA的拼接。(4)改變mRNA的二級結構反義核酸與mRNA結合，mRNA二級結構發生改變,使RNA降解加速。(5)通過Hoogsteen堿基配對形式（T-A-T，C-G-C）反義核酸與雙股DNA基因結合，形成三股螺旋結構，阻止靶基因復制或競爭抑制激活轉錄的蛋白與基因啟動子結合，從而干擾基因轉錄(反基因技術)。(6)與單鏈DNA結合成雙鏈結構以阻止靶基因的復制或轉錄。(7)與引物RNA結合，抑制DNA的復制。(8)作用于polyA形成位點，阻止mRNA的成熟及其向胞漿中的轉運。(9)作用于mRNA5′端編碼區，如起始密碼AUG，阻止完整的RNA翻譯，從而進一步阻止蛋白質的產生。第三節核酶核酶是指由RNA組成的酶。在天然情況下，核酶可催化RNA切割和RNA剪接反應。6個天然存在的核酶結構已得到鑒定，其中最著名的是錘頭狀和發夾狀核酶。具有催化RNA切割的核酶可作為基因表達和病毒復制的抑制劑，目前已被開發用于基因治療。一、給藥方法由于核酶分子較大，故核酶不能像AODN一樣通過受體介導的機制進入細胞，需通過特殊的方法導入。1.轉染后內源性表達和外源性給藥 載體構建物進入細胞后內源性表達核酶，但該法具有逆轉錄病毒載體的某些缺點如可能發生插入誘變。2.病毒載體逆轉錄病毒載體和腺病毒載體已用于核酶的釋放。另一種方法是應用腺相關病毒（adeno-associatedvirus,AAV）載體，它能以非隨機的方式整合到第19號染色體DNA中。3.攜帶多個核酶結構域的表達載體 這類多聚體酶造物似乎比相應的反義RNA或攜帶單個核酶結構域的轉錄子能更為有效而特異性地抑制氯霉素乙酰轉移酶的表達。4.體內轉錄方法該法的缺點是限制了核酶發展為一種穩定的具有特定長度和催化功能的RNA分子的潛力。上述問題可以通過如下方法加以解決，即合成一個轉錄子，在其特定的反式作用核酶側翼替換為另外兩個順式作用的錘頭狀或發夾狀核酶。目前，由于缺乏有效的基因轉移方法，這種方法尚不能用于治療。5.核酶與易于進入細胞的分子耦聯 由于進入細胞內質小泡（endocytoplasmicvesicle）后，核酶易被溶酶體酶所降解，故限制了該法的應用。6.脂質體介導核酶轉移進入細胞 這種方法與ODN結合脂質體釋放給藥相似。脂質體囊的反義分子的抑制活性比非囊化分子高100倍。不經過脂質體囊化的OND和核酶僅通過離子相互作用結合在表面。因此，脂質體介導有利于ODN的進入，而不會隨后因進入內吞小泡而易于被降解。一個理想的核酶表達載體應具有以下特征：①轉錄效率高；②可產生穩定的RNA；③轉錄的核酶不具有抑制性的二級結構；④核酶與底物定位于同一個亞細胞區室內。如果將核酶等RNA控制劑成功地輸送到亞細胞區室中指定的靶點，必須弄清啟動子策略以及特定預期位置的RNA信號。一種策略是將核酶包埋入用bonafide逆轉錄病毒轉錄子包裝的假病毒轉錄子中，這樣可能直接接近靶序列。Good等（1997）利用人U6啟動子和不同量的U6RNA編碼序列表達了小核酶、反義RNA以及抗HIV-RNA與蛋白質的RNA反聚體（aptamer）釣鉺。結合RNA的Rev可有效地阻斷HIV-1基因表達，然而利用上述元件表達的其他RNA則幾乎沒有作用。二、臨床應用潛力與傳統藥物不同，核酶是破壞遺傳信息流，而不抑制蛋白質功能。核酶靶向特定mRNA的治療潛力非常巨大，是一種治療疾病的新方法，尤其是一些因RNA異常表達所致的疾病如癌癥和病毒感染的治療。根據其催化特定的反應，目前正從完全隨機的RNA池中選擇新的核酶。在進行的基因轉移或酶治療中，這些核酶能取代其相應的蛋白質部分。核酶有望開發成為一種可用于治療腺苷脫氨酶缺陷、Gaucher病以及其他一些因mRNA前體（premRNA）異常剪接所致遺傳病的藥物。（一）核酶作為抗病毒藥物的潛力核酶能特異性地抑制病毒基因表達與復制，是一類極有希望的藥物。它們不僅可以順式而且還可以反式切割靶模體，這使得錘頭狀核酶成為抗病毒研究的前沿。由于病毒靶序列一般不存在于已感染的宿主細胞基因組中，因而，反義核酶不必為序列選擇性的。與短的反義ODN或合成的核酶相比，長鏈反義RNA（30個堿基）或具有長反義臂的核酶并非處于劣勢。當病毒處于潛伏期感染，其基因表達處于低水平時，采用核酶進行治療可能更為有效，但該法難以處理完全活化的病毒基因表達和復制。下列病毒感染是核酶治療潛在的靶子：(1)HIV-1感染；(2)乙型、丙型和丁型肝炎病毒感染；(3)A型流感病毒感染；(4)淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染；(5)牛白血病病毒感染；(6)Ⅰ型和Ⅱ型人嗜T淋巴細胞病毒（HTLV）感染。（二）核酶用于治療HIV感染HIV-1為RNA基因組，在其病毒基因組和亞基因組RNA上含有多個潛在的核酶切割位點。由于病毒可迅速發生突變。故只抑制單個靶病毒的抗病毒藥物往往對此束手無策。具有同時靶向許多不同位點以抑制HIV-1的多聚核酶已成為另一個重要的治療方法。核酶可在病毒生活史中的兩個部位上有效地抗HIV-1感染。第一個是感染后不久與前病毒DNA形成之前，此時所有的或部分病毒基因組仍以RNA形成存在。第二個是在已發生整合的前病毒形成之后，此時產生了經過剪接的和全長的轉錄本。特別值得注意的是，HIV-1能感染靜止期的淋巴細胞，在這種細胞里已開始了前病毒DNA的合成，但是不完全的反轉錄。如果核酶存在于細胞質中，它可在T細胞活化前通過在上述第一步切割RNA以防止細胞持續受感染。研究顯示，靶向5’UTR序列上某個位點的發夾狀核酶的表達可使細胞中HIV前病毒DNA的形成降低50～100倍。當靶向tat中的保守位點并共享tat-rev外顯子的錘頭狀核酶利用莫洛尼（Moloney）病毒載體LTR進行表達時，可保護培養細胞免受病毒感染至少達21天。這種抗tat和tat/rev核酶已通過轉導進入衍生于造血CD34+干細胞的人骨髓，使多能干細胞分化成單核細胞系，并與HIV-1競爭。與只轉導病毒載荷量相等的對照細胞相比，能表達核酶的細胞可免于病毒感染。Rossi（1995）報道了一種新的核酶-靶共定位策略，它利用RT的tRNALys3引物作為載體將核酶導入密切相關的HIV基因組RNA中，很可能進入病毒體（virion）本身。該策略是根據已知的HIVRT與細胞tRNALys3之間的相互作用而提出的，其中tRNALys3是所有哺乳動物慢病毒（lentivirus）均使用的引物。應用該法獲得的結果小結如下：(1)tRNA-核酶選擇性地與HIV逆轉錄酶結合，親和力與合成的tRNALys3一致。(2)轉染進入人胚細胞后，tRNA-核酶為PolⅢ轉錄。(3)tRNA-核酶可被輸送到細胞質中，使之能夠與逆轉錄酶結合。(4)當tRNA-核酶經短暫轉當進入293細胞時，沒有與內源性tRNALys3相當水平的Trna-核酶轉錄本。(5)tRNA-核酶基因與HIV-1DNA共轉染進入293細胞后，與對照組織相比，病毒感染可降低4~21倍。目前正對艾滋病患者進行發夾狀核酶的臨床試驗。（三）核酶與癌癥治療核酶是通過抑制mRNA翻譯阻斷蛋白質的合成。由于腫瘤形成的一個重要特征是產生能轉化細胞的變異蛋白質，因此，核酶具有潛在的抗腫瘤作用。Kashani-Sabet和Scanlon（1995）對核酶在癌癥基因治療中的應用進行了專題評述。隨著核酶介導抑制作用的成功報道，多名研究人員探討了核酶用于癌癥治療的潛力。核酶介導的潛在的切割靶目標有：(1)融合轉錄本：bcr/abl、Ig/bcl2、alk/NPM和dek/can；(2)細胞調控基因的轉錄本：cdk2；(3)抗調亡基因的轉錄本：bcl-2和bcl-x；(4)靜止細胞的（cytostatic）抗性基因轉錄本：MDR-1、MGMT和拓撲異構酶；(5)核轉錄因子：c-myc、N-myc、c-myb、c-foc和c-jun。研究發現，核酶在研究基因調控、抗病毒復制和滅活癌基因方面具有巨大潛力。核酶靶向技術顯示，u-myc直接參與誘導調亡，并可在分子水平調控細胞凋亡。多種癌癥模型研究顯示，核酶優于反義治療。然而，核酶介導癌治療的靶子主要為癌基因，如在10%-15%的人類癌癥中具有突變的G蛋白的ras家族，以及見于慢性髓性白血病的bcr-abl嵌合基因等。核酶若要成功地應用于臨床尚有待于進一步的臨床試驗研究，同時還需要研究多種不同的給藥系統，以確定一種最佳的癌癥治療方法。開發一種成功的可用于癌癥基因治療的核酶方案還需要符合多方面的要求，其中最重要的是選擇合適的臨床前（體內和體外）和臨床模型系統，同時還應考慮開發適當的載體以確保設計的核酶正確進入靶細胞并表達。功能的設計與改造核酶基因治療的一個重要目標是細胞內必須有足量的核酶，以保證結合和切割。一項通過核酶分子與靶RNA在細胞內共定位以提高有效作用水平的研究取得了令人振奮的結果。核酶與底物RNA示蹤細胞生物學必將是一個極其重要的研究方向。第四節AODN的藥效學評價[5-7]具不完全統計目前在動物體內評價的反義藥物有10余種，其中抗腫瘤作用的7種，抗病毒作用的1種，其它如作用于心血管、代謝、免疫及細胞粘附系統的有4種。詳見表4-2。動物體內的這些結果,已成為反義藥物開發的基礎。表4-2整體水平反義藥物藥效學評價結果[5，6，7]靶基因動物模型反義藥

物種類長度

(nt)劑量及活性C-raf-1異植A549肺癌裸鼠硫代206mg/kg,i.v,1次/日.腫瘤生長及c-raf激酶mRNA呈劑量依賴性降低.PKC-aSK-1小鼠硫代20100mg/kg/200ml/日,i.p.,7日.肝臟PKC-amRNA下降90%.C-myc1.Em-c-myc轉基因小鼠

2.CD-1裸鼠的人黑色素瘤異植物硫代

硫代15

18預防性治療,20mg/kg/日,s.c.,6周.75%反義治療鼠26周后仍未見腫瘤生長,而95%對照組鼠在16周時出現腫瘤.0.25,0.5,1mg/只/日,i.v.,8日,也用其它治療方案.可見序列特異性的腫瘤生長抑制、肺癌轉移數下降及壽命延長.C-myb1.K562細胞異植Scid小鼠

2.球囊擴張動脈損傷大鼠硫代

硫代24

18100mg/日,14日.反義治療鼠存活時間是正義治療鼠及未治療鼠的3-8倍.損傷后即在動脈局部應用200mg反義藥物,連續14日.損傷幾乎完全恢復,但僅見于與藥物接觸的局部.NF-kB

(p65亞單位)1.HTLV-1Tax轉基因小鼠成纖維瘤

2.裸鼠的皮下異植人纖維肉瘤或黑色素瘤3'端硫代+天然硫代21

18-24腫瘤建立后7日開始治療,40mg/g.wt/每3日,i.p.,連續15日.8日后腫瘤明顯縮小,15日后完全消失.1.4mg/只,二次/周,s.c.,或2.8mg/只,經泵給藥14日,腫瘤細胞注射前或后72小時開始治療.70%反義治療鼠腫瘤明顯縮小,上述方案的結果相同.IL-1受體小鼠中性白細胞刺激誘導IL-1硫代183nmol/日,s.c.,3日,IL-1注射前24小時開始治療.中性白細胞活動度降低40%.黃體酮受體卵巢切除大鼠脊柱前凸行為誘導黃體酮天然18經直達腹側正中下丘腦的雙向導管單次腦內注射400ng藥物.雌鼠動情期反應明顯降低,70%表現無性別感受性.加壓素受體成年雄性Wistar大鼠末端帽狀硫代210.5mg/ml,0.5ml/h輸注.在焦慮相關性行為中,血管緊張素結合呈序列特異性降低.血管緊張素原8周齡先天性自發性高血壓雄性大鼠天然162.5ml含藥脂質體溶液經門靜脈或直接注射肝臟.血壓呈序列特異性降低.BCR/ABL人Ph白血病細胞異植Scid小鼠硫代261mg/日,i.v.,連續9日.BCR/ABLmRNA水平降低,小鼠存活期延長.HBxHBx轉基因小鼠模型硫代271mg/只/日,i.p.,連續7日.HBx基因轉錄物水平明顯降低.0.2-1mg/只,i.p.,3次/周,8周.HBx蛋白明顯減少,且可阻止肝癌前損傷.PKA人結腸癌細胞異植裸鼠硫代2150mg/kg,單次s.c..腫瘤生長呈劑量依賴性抑制.DHBV鴨乙肝病毒感染的北京鴨硫代18感染后第三天給藥,20mg/kg/日,9日.病毒呈劑量依賴性和序列特異性抑制,肝臟病毒DNA幾乎完全清除.注：i.v.靜脈注射，i.p.腹腔注射，s.c.皮下注射.第五節反義技術的應用目前最有希望的是抗病毒類藥物，因為已對許多致病病毒的基因及其編碼蛋白有較多了解，并且病毒的主要蛋白在人體中大部分無相應蛋白種類，所以抗病毒的AON藥物對人類正常基因干擾很小。一、抗病毒劑（一）人類免疫缺陷病毒（HIV）-1反義寡核苷酸抗病毒活性采用以下4種機制：(1)與脂質體囊化的硫代磷酸寡核苷酸不同，ODN還可獨立地干擾病毒介導的細胞融合；(2)α和β構型硫代磷酸寡核苷酸通過非特異性方式干擾逆轉錄；(3)α和β構型磷酸二酯寡核苷酸通過序列特異性及RNAase-H非依賴性方式干擾病毒逆轉錄；(4)β硫代磷酸寡苷酸通過序列特異性及RNAase依賴性方式干擾病毒mRNA。反義核苷酸提供了一種選擇性阻斷HIV基因表達的方法。與其他逆轉錄酶一樣，HIV也合成其主要結構蛋白，并以一種多肽前體（gag55）形式存在。該前體蛋白經病毒蛋白水解酶消化，形成成熟的病毒蛋白p17、p25和p15。研究顯示，反義寡核苷酸是通過與靶mRNA序列特異性雜交抑制病毒和細胞基因表達。病毒RNA包裝所必需的序列位于gag起始密碼子附近，并形成穩定的二級結構。與HIVGagmRNA起始密碼子互補的寡核苷酸可阻斷GagmRNA的翻譯，同時也破壞了RNA的二級結構。抗HIV基因治療的主要目標是開發一種有效的基于反義技術的抗HIV策略，它可特異性地靶向HIV-1mRNA上一些必需和保守的區域，最好是多個區域。存在于所有HIV-1mRNA或病毒基因組本身兩端的HIV-1TAR區是Tat反式激活所必需的，因此符合上述標準。正在開發用于治療HIV-1的各種反義化合物如下：1.基因表達調節劑GEM-91（Hybridon公司，Worcester，MA）這是一種新的25聚體反義寡核苷酸，它可與HIV-1RNA的gag基因起始密碼子互補。GEM-91通過阻斷gagmRAN基因起始密碼子互補。GEM-91通過阻斷gagmRNA的翻譯以及破壞病毒裝配過程和二聚體形成期所必需的RNA二級結構抑制HIV復制。目前GEM-91正在進行Ⅱ期臨床試驗。2.多聚L-賴氨酸耦聯的寡核苷酸 可促進序列特異性地抑制多種生物學模型中急性HIV感染，但目前尚未進行臨床試驗。3.反義寡核苷酸的脂質體化與游離于溶液中的同一寡核苷酸相比，摻入特定脂質體的寡核苷酸對慢性感染細胞中HIV-1復制的抑制作用可增強數倍。反義寡核苷酸對逆轉錄病毒的抑制作用可通過胞內穩定性進行測定。這些化合物均未進行臨床試驗。4.由脫氧鳥苷和脫氧胸苷組成的寡核苷酸這種寡核苷酸可抑制感染細胞培養測定系統中的HIV-1活性。寡核苷酸骨架上的硫基團雖可增強其抗病毒活性，但缺乏序列特異性相互作用，提示寡核苷酸藥物的部分抗菌毒活性來自其非反義機制，而并非這些化合物最初所設想的機制。5.反義基因技術 這項技術涉及抑制HIV生長所需的基因功能，而不影響其他基因。潛在的臨床應用包括從患者體內去除某些基因。經過改造的細胞將被重新輸回患者體內，從而期望這些細胞發揮抗HIV的免疫保護作用。6.RNA釣鉺 轉顯性調控蛋白（regulatorytransdominantprotein）Tat和Rev分別與新生病毒RNA的特定區域即TAB和RRE結合以激活HIV基因表達。RNA釣鉺通過模擬上述這些RNA結構，引起HIV調控基因發揮功能所必需的病毒/細胞因子與螯合而發揮作用。垂釣RNA發生結合時與HIVRAN很相似，但它們結合后并不重建功能。通過這種方法它們可垂釣病毒增殖所必需的病毒/細胞因子。利用基于Rev結合元件的釣鉺，即RNA-DNA嵌合寡核苷酸可能是一種更安全的基因治療方法，可降低HIV感染者體內的病毒量。7.整合酶抑制劑 研究表明，AR177（Aronex制藥公司）作為一種新寡核苷酸具有抑制HIV整合酶和防止細胞融合的作用。這種化合物已開始在HIV陽性患者進行I期臨床試驗。（二）單純皰疹病毒（HSV）感染寡核苷酸具有抗HSV作用。Fennewald等（1995）研究發現，完全由脫氧鳥苷（GT）組成的寡核苷酸雖然并非為特異設計的反義藥物，但能明顯抑制急性感染測定系統中單純皰疹病毒的生長。雖然這種作用的確切機制尚不清楚，但這些寡核苷酸具有毒性低和治療指數高的優點。這些化合物作為抗皰疹病毒的治療藥物尚有待于進一步研究。（三）巨細胞病毒感染Gilead科學公司生產的核苷酸類似物cidofovir（Vistide）已進行了隨機對照的Ⅲ期臨床試驗。靜注給予Vistide可延緩艾滋病患者CMV視網膜炎進展的時間，初次治療1周1次，維持治療2周1次。另一反義化合物AR132（Aronex制藥公司）也正在開發為用于治療CMV感染的藥物。（四）病毒性肝炎研究顯示，乙型和丙型病毒性肝炎對反義寡核苷酸敏感。最近的研究發現，反義寡核苷酸具有抗丁型肝炎病毒（hepatitisdeltavirus,HDV）的活性。HDV是攻擊性最強的一種肝炎，肝炎患者中15%為HDV。HDV還可迅速發展為肝硬化，它也可與HIV以共感染的形式存在。二、抗癌劑腫瘤的治療是醫學上的一大難題。目前認為腫瘤的成因是機體正常細胞內的原癌基因通過擴增、轉位或突變轉變為有活性的癌基因，或基因調控失效，如：抗癌基因失活引起某些細胞癌基因的過度表達。臨床上所用的腫瘤化療方法特異性差，效果不好。設想通過反義技術可特異性地抑制相應癌基因的過度表達而抑制腫瘤細胞的增殖。（一）抑制與腫瘤生長有關的基因通過反義ras逆轉惡性表型，多種策略已用于逆轉激活的ras基因的致瘤效應。由于位于H-ras下游的c-fos癌基因與信號轉導有關，故反義fosRNA已用于顯示人膀胱癌EJ細胞轉化表型的部分逆轉。研究顯示，脂質體介導內轉移反義K-ras構建子可抑制鼠腹膜腔中胰腺腫瘤的播散。反義ODN通過靶向細胞信號轉導抑制腫瘤生長，該技術的靶子為PKC-a和c-raf。含有20個核苷酸的ODN（ISIS3521）是以絲氨酸/蘇氨酸激酶PKC-a（一種在磷酸肌醇信號轉導途徑中作為細胞內受體的PKC的同工酶）為靶子，可抑制裸鼠中人腫瘤細胞系。該途徑在癌細胞中常被激活，預期PKC-a的表達可終止或減緩腫瘤增殖。一項Ⅰ期臨床試驗顯示，ISIS3521可使癌癥轉歸。靶向另一種信號轉導途徑成分c-raf激酶mRNA可減緩小鼠體內移植腫瘤的增殖。但該法的缺點是反義藥物必須長期服用治療才有效。這些方法是成功應用將有賴于對信號轉導級聯反應途徑中多個步驟的抑制，并很可能需要多個不同分子工具的聯合應用。（二）反義ODN抑制生長因子表達Rubinstein等（1994）曾就此作了專題評述并報道，反義ODN因可抑制生長因子表達而成為治療激素非敏感性乳腺癌和前列腺癌的首選藥物。ODN直接針對編碼生長因子如TGF-a的mRNA。表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor,EGF-R）在人橫紋肌肉瘤細胞增殖中的作用顯示，該受體可成為反義治療的靶點。脂質體介導轉移含有反義源堿性成纖維細胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）或FGFR-1的附加型載體進入生長在裸鼠上作為皮下腫瘤的人黑色素瘤中，可導致這些腫瘤生長的抑制或轉歸，這可能是由于抑制了腫瘤內血管生長，繼而引起腫瘤細胞壞死的結果。因此，對bFGF/FGFR-1介導的信號轉導的抑制作用可能為進展期黑色素瘤的治療提供了一種新手段，血管內生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）是Kaposi肉瘤自分泌產生的一種生長因子，其中Kaposi肉瘤是與艾滋病相關的最為常見的腫瘤。VEGF反義ODN可特異性地抑制裸鼠中Kaposi肉瘤細胞的生長。垂體細胞生長及功能發揮需要多種生長因子。這些肽的異常表達或調控對于垂體腫瘤的存在極其重要。研究發現，反義抑制甲狀旁腺素相關肽（parathyroidhormone-related,PTHrP）基因的表達可阻止大鼠垂體腫瘤的發展和轉移。這項技術可能為控制人類惡性垂體腫瘤的轉移提供了一種新的治療方法。（三）與抗腫瘤藥合用在療效不變的同時,減少各自的用藥劑量，從而降低毒性。主張化療（環磷酰胺）與bcr-abl反義ODN結合的證據支持了Skorski等（1997）對嚴重聯合免疫缺陷（severecombinedimmuodeficient，SCID）小鼠Ph1白血病的實驗研究。研究結果及其分子基礎小結如下：①在攜帶CML-胚母危象細胞（blastcrisiscell）的SCID小鼠中，聯合治療可延緩白血病的進展；②50%經治療小鼠的白血病可治愈；③經處理的白血病細胞可加速凋亡；④體外研究顯示，與化療配合可提高對反義bcr-abl的攝取。反義治療還可恢復多藥耐藥性（multidrug,MDR）腫瘤細胞對藥物的敏感性。Cucco和Calabretta（1996）用靶向mdr1mRNA的反義ODN處理SCID小鼠及體外處理長春花新堿抗性的人早幼粒細胞系HL-60/Vinc，結果表明，給予反義ODN后可使體外抗性細胞的敏感性提高120倍。注射HL-60/Vinc的SCID動物于84天內全部死亡，然而，60%經過長春新堿與反義ODN的小鼠300天時仍可存活。因此，反義治療有可能逆轉癌癥患者的MDR。（四）腫瘤反義治療的體內給藥問題目前缺乏有效地轉染靶細胞以用于基因置換或治療腫瘤的方法。反義分子只轉入腫瘤細胞是一種理想的方法。穩定的反義RNA表達系統在鑒別靶目標方面可能有著極大的優勢，這將有利于體內ODN應用時的調控。目前采用的方法簡述如下：1.局部給藥利用植入的微型泵可將大劑量ODN局部釋放到皮下腫瘤。2.全身給藥靜脈內給予抗腫瘤藥物ODN對實驗動物和病人均有效。3.脂質體反義復合物脂染素（lipofectin）可增強細胞對反義ODN的攝取，同時也可抑制腫瘤細胞生長。4.病毒載體病毒載體常用于回體（exvivo）基因治療。由于該法比體內法更有效，故在臨床試驗中較常使用。病毒載體能夠進入腫瘤細胞，并可使反義分子表達，同時它也可進行選擇性表達。如果將反義序列置于調控序列的控制下，那么它只在某種特定的譜系或某種特定類型的腫瘤細胞中表達。病毒中含有的DNA序列所調控的某些癌癥，如對甲胎蛋白或癌胚抗原應答，就可具有特異性。前體藥物激活酶可行腫瘤特異體傳遞，這表明了該基因療法的可行性。三、作用于神經系統（一）神經退行性變性疾病興奮性氨基酸與肌萎縮側索硬化癥和阿爾茨海默病等神經退行性變性疾病有關。Berman等（1995）的研究表明，反義ODN能降低N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）在神經元中的興奮性毒性，表明這類藥物具有治療NMDA介導的神經退性變性疾病的作用。另一種治療神經退行性變性疾病的反義策略是基于p75。P75通過與神經生長因子（nervegrowthfactor，NGF）結合，切斷對神經細胞NGF的供給，從而導神經細胞死亡。P75又稱為“自殺分子（suicidemolecule）”。現已設計出一種反義ODN，它可與指導p75產生的RNA結合。目前該藥物仍處于動物實驗階段。（二）腦血管疾病對于腦缺血后發生的一系列分子事件目前并不完全清楚。動物腦卒中模型研究顯示，基因表達發生改變。腦缺血后發生的生化事件包括興奮性氨基酸的增高。谷氨酸受體介導的磷脂酶與蛋白激酶的激活可引起立刻早期基因（immediateearlygene）如c-fos和c-jun的表達。已知Fos和Jun蛋白可形成激活蛋白1（activatorprotein1,AP-1），AP-1可調控其他幾種基因的表達。但研究表明，這種活性可被反義c-fos寡核苷酸所抑制。反義寡核苷酸有可能成為治療腦卒中的新方法。腦室內滴注靶向NMDA谷氨酸受體亞基之一的反義寡核苷酸可降低大鼠腦卒中模型中皮質梗死的大小。（三）反義技術用于調節神經遞質眾所周知，可與轉運蛋白相互作用的可卡因和安非他明衍生物等這類化合物存在著濫用的可能性。因此，有必要設計出一些可選擇性抑制單一類型神經遞質的分子，以免濫用。反義敲除技術（antisenseknockoutapproach）可用于抑制多巴胺轉運蛋白（dopaminetransporter，DAT）的活性。利用含有DAT的培養成的人成神經細胞瘤細胞測定一種稱為pcDAT-A的新制備的載體的活性，該載體以反方向表達完整的大鼠多巴胺轉運蛋白rDAT-1。同時對相應于DAT-1不同部分的3個合成的18聚體寡核苷酸也進行了測定。攜帶其中一個寡核苷酸（與編碼第3個跨膜結構域的5’區反義）的pcDAT-A載體可阻斷對3H多巴胺的攝取，同時還具有部分阻斷多巴胺毒性的作用。四、心血管疾病（一）高血壓腎素-血管緊張素在調節血壓方面起著重要的作用。血管緊張素原是血管緊張素I和血管緊張素Ⅱ的前體。高水平血管緊張素原與高血壓相關。研究表明，轉染抗大鼠血管緊張素原反義ODN可短暫降低自發性高血壓大鼠（spontaneouslyhypertensiverat,SHR）的血壓，同時也降低血管緊張素Ⅰ和Ⅱ的水平。Wielbo等（1996）利用脂質體囊化的ODN對SHR進行了類似的實驗，結果表明，該制劑可更有效地降低高血壓。反義ODN是能過阻止mRNA翻譯成血管緊張素原而發揮上述作用的。Gyurko等（1997）通過腦室內（intracerebroventricular,ICV）給予SHR大鼠靶向AT1血管緊張素受體mRNA的反義ODN，并將此結果與皮下注射反義ODN的大鼠進行了比較。結果發現，單獨應用ICV注射的反義ODN而非皮下注射ODN可明顯降低血壓達7天之久。這種長效機制可能是由于反義ODN在核內持續存在，從而阻止mRNA轉運到細胞質中所致。（二）血管成形術后再狹窄的預防基因治療已用于防止再狹窄。反義ODN策略也可用于抑制血管平滑肌損傷后的增生。Morishita等（1995）利用含有E2F結合位點的釣鉺寡脫氧核苷酸轉染血管平滑肌細胞（vascularsmoothmusclecell,VSMC），結果表明，該技術可防止必需的細胞周期調控基因的反式激活，并抑制VSMC增殖。研究顯示，該法可有效抑制大鼠動脈模型氣囊損害后新內膜的形成。此外，反義轉錄大鼠胰島素樣生長因子1受體（insulin-likegrowthfactor1receptor）cDNA可抑制VSMC。另一項研究則證實了冠脈內給予反義ODN防治臨床試驗中的再狹窄的安全性，其中反義ODN以原癌基因c-myc為靶點。（三）血管移植物中動脈粥樣硬化的預防Suzuki等（1997）利用HVJ脂質體釋放細胞周期蛋白依賴的激酶2的寡核苷酸（oligo）進行冠狀動脈灌輸，結果表明該方法可減少鼠異向心臟同種異體移植物中的新內膜形成。（四）動脈血栓形成的防治有人研究了一類完全不同的基于單鏈寡核苷酸的凝血酶抑制劑。Li等（1994）合成了一段摻有共有序列（consensussequence）的15聚體（凝血酶反聚體），并測定了其在離體的主動脈血管形成術模型中抑制凝塊結合的凝血酶活性和血小板血栓形成的效果。實驗表明，血小板沉積減少34.5%。基于單鏈寡核苷酸的凝血酶反聚體是一類新的凝血酶抑制劑，它具有較強的抗凝和溶栓特性。五、炎癥性疾病科學家正在研究反義治療在下列炎癥性疾病中的應用：①類風濕性關節炎；②牛皮癬；③潰瘍性結腸炎；④Crohn病；⑤腎移植排斥；⑥哮喘。治療的各種策略簡述如下：（1）靶向細胞間粘附分子（intercellularadhesionmolecule,ICAM）1aRNA的反義ODN。這種策略的理論基礎是ICAM-1參與炎癥細胞的激活以及炎癥細胞從血液遷移到組織中。通過反義非特異性機制（很可能是由于寡核苷酸內在特性）以及預期的序列特異性機制可抑制ICAM-1的表達。（2）為應答炎癥刺激，可誘導一組與循環白細胞（內皮白細胞粘附分子）結合的蛋白質在血管內皮表層表達。合成的ODN可選擇性地與編碼下述3種內皮白細胞粘附分子（endothelial-leukocyteadhesionmolecule）的mRNA結合：人ICAM-1、血管壁粘附分子1（vascularwalladhesionmolecule-1，VCAM-1）和E-選擇素（E-selectin）。（3）蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）除了參與細胞內信號轉導外，還在炎癥過程和其他幾種疾病中發揮作用。反義ODN可抑制PKC基因的表達。雖然潰瘍性結腸炎與Crohn病存在多種相同的特征，但有證據表明這兩種疾病性質并不完全相同。潰瘍性結腸的發病機制非常復雜，組織損害可能與遺傳因素、外源性促發物和粘膜免疫效應物間的相互作用有關。但一般認為這兩種疾病均是炎癥性疾病，免疫調節策略是處理這兩種疾病的各種方法中的一種。一項Ⅱ期臨床試驗顯示，靜脈內給予反義ODNISIS2302對Crohn病患者有效。20例患者經過1個月的治療，經半數患者出現緩解，平均緩解時間約為5個月。此外，皮質類固醇服用劑量也明顯降低。目前該化合物正試用于其他炎癥性疾病如類風濕性關節炎、牛皮癬和潰瘍性結腸炎癥。局部給予p65反義藥物可改善小鼠實驗性結腸炎。在慢性結腸炎中，轉錄因子p65明顯被激活。這項研究表明，p65反義技術對Crohn病患者具有潛在的治療作用。哮喘是一種以支氣管反應性為特性的炎癥性疾病，并可引起危及生命的氣道阻塞。有證據表明，參與正常生理功能的內源性腺苷可能是引起哮喘的一個重要介質。哮喘患者支氣管灌注液中腺苷濃度增高。Nyce和Metzger（1997）利用塵螨過敏反應性人哮喘免疫模型進行了一項隨機交叉研究。靶向給予腺苷A1受體的氣霧化反義ODN可使動物對腺苷或塵螨過敏原脫敏。上述研究結果提示，肺可能是反義ODN治療哮喘以及肺部其他炎癥性疾病的一個潛在的靶子。第六節臨床研究表4-3已進入臨床試驗的ASODNs藥物作用靶治療疾病臨床(期)開發公司HCMV(ISIS2922)艾滋病患者視網膜炎進入市場Isis/CIBAVisionICAM-1(ISIS2302)Crohn's病

類風濕關節炎

牛皮癬

潰瘍性結腸炎

腎移植排斥II

II

II

II

IIIsis/BoehringerIngelheimPKC-a(ISIS3521/CGP64128A)癌癥IIIsis/NovartisC-raf(ISIS5132/CGP69846A)癌癥IIIsis/NovartisHIV(ISIS5320)艾滋病I/IIIsisHas-ras(ISIS2503)癌癥IIsisHCMV(GEM132)全身性巨細胞病毒感染

巨細胞病毒性視網膜炎II

I/IIHybridonHCMV(ISIS13312)艾滋病患者視網膜炎IIIIsisHIV(GEM91)艾滋病II期后撤除HybridonLR-3280球囊擴張后再狹窄的預防IILynx/Schuarz/TanabeBCL-2(G3139)非何杰金氏淋巴瘤

急性髓性淋巴細胞性白血病

慢性髓性淋巴細胞性白血病

骨髓凈化I/II

I/II

I/II

I/IIGenta

Lynx

Lynx

LynxHIV(AR177)艾滋病IAronexHIV(Gps0139)艾滋病IChugaic-myb(c-myb)急性髓性淋巴細胞性白血病

慢性髓性淋巴細胞性白血病I/II

I

c-myc(c-myc)再狹窄I

HIV(GEM92)艾滋病IHybridonPKA(GEM231)癌癥IHybridonVEGF視網膜炎IHybridonHPV(ISIS2105)人乳頭瘤II期后撤除Isis針對c-myb的硫代寡核苷酸在白血病治療方面初步顯示了良好的臨床效果，5名白血病患者接受白消胺及環磷酰胺治療后，再輸入反義藥物凈化的單核細胞，其血液指標呈現持續緩解。在18名頑固性白血病患者中，c-myb寡核苷酸0.3mg/kg/日或2mg/kg/日，連續7日，靜脈輸注，未見劑量相關性毒性作用，1例患者存活了14個月。另1例進展期慢性白血病患者，采用自身骨髓體外反義藥物處理后再回輸療法，在治療9個月后血液學指標完全恢復正常。

互補于bcl-2的硫代寡核苷酸(G3139)已進入II期臨床試驗，在9例頑固性非何杰金氏淋巴瘤治療中，每日皮下注射1次，連續2周，僅見注射部位局部炎癥，未見其它藥物相關性毒性作用，2例患者CT提示腫瘤明顯縮小，2例患者血液中瘤細胞數減少，4例患者血清LDH降低，其中2例癥狀改善，采用流式細胞技術對5例患者bcl-2蛋白水平檢測提示其中2例明顯降低。

ISIS2302是互補于ICAM-1的硫代寡核苷酸，在20例類固醇治療的活動性Crohn's病患者的雙盲對照試驗中，以0.5、1、2mg/kg劑量靜脈輸注26天，觀察到治療組47％(7/15)的患者病情緩解，對照組20%(1/5)的患者病情緩解，半年后隨訪，7例病情緩解者中有5例病情持續穩定，1例考的松用量降低。在ISIS2302治療期間，外周血淋巴細胞明顯增加，腸粘膜ICAM-1表達水平下降。另有2例并發瘺管形成的患者，經ISIS2302治療后，瘺管痊愈，消化道梗阻癥狀緩解，隨訪1年未見復發。該結果提示在類固醇依賴性Crohn's病治療中，ISIS2302能使病情緩解，并可使患者擺脫對類固醇的依賴性。

ISIS3521/CGP64128A在I期臨床試驗中，治療4例卵巢癌患者，1例呈現部分反應，2例卵巢癌標志物CA-125降低，目前，ISIS3521/CGP64128A進入II期試驗，治療各種實體瘤包括卵巢癌、前列腺癌、腦瘤及結腸癌等，將在北美及歐州注冊200例，預計1年完成。

GEM132是第一個進入臨床試驗的第二代反義藥物，其兩端各有一個修飾RNA保護帽，從而加強了代謝穩定性，在組織培養中，GEM132抗病毒活性是ganciclovir的1000倍，對ganciclovir抗性巨細胞病毒分離株對GEM132仍敏感。GEM132單劑量安全性檢測顯示耐受性較好，目前已進入I/II期臨床試驗，用于治療全身性巨細胞病毒感染及巨細胞病毒視網膜炎。

VitraveneTM(ISIS2922，formivirsensodiuminjectable)是1998年8月26日經美國FDA批準第一個進入市場的反義藥物，主要用于局部治療對其他治療措施不能耐受或有禁忌以及對巨細胞病毒性視網膜炎治療方案沒有明顯效果的艾滋病人巨細胞病毒性視網膜炎。主要副作用為眼球發炎或虹膜炎或玻璃體炎,發生率約為25％,延緩治療以及用通常的腎上腺皮質激素治療可使炎癥解除。第七節反義技術的價值反義藥物作為一種具有高度選擇性和低毒性的基因治療藥物，已愈來愈受到藥商和醫藥研究人員的青睞，是潛在的藥物和探索的工具。反義藥物與傳統藥物相比作為治療劑具有以下優點:1.特異性較強一個15聚體的反義寡核苷酸含有30-45個氫鍵，而低分子的傳統藥物與靶點一般只形成1-4個鍵。2.信息量較大遺傳信息從DNA-RNA-蛋白質，用互補寡核苷酸阻斷某種蛋白的合成是很準確的。反義藥物以核酸為靶點,根據核酸雜交原理，反義藥物能與特定基因雜交，干擾遺傳信息從核酸向蛋白質的傳遞。蛋白質在人體代謝中扮演非常重要的角色，幾乎所有的人類疾病都是由蛋白質的異常引起的，無論是宿主疾病(腫瘤等)還是感染疾病(肝炎等)。傳統藥物主要是直接作用于致病蛋白本身，反義藥物則作用于產生蛋白的基因，因此可廣泛應用于多種疾病的治療，如傳染病、炎癥、心血管疾病及腫瘤等。與傳統藥物比較反義藥物更具選擇性及效率，因此也更高效低毒。更易合理設計新型藥物。第八節反義藥物的給藥途徑表4-4寡核苷酸的各種給藥方法給藥方法靜脈內口服皮下皮下腫瘤的離子電滲療法（iontophoreticdelivery）眼睛局部應用血管成形術中動脈導管給藥（transcatheterdelivery）經特殊技術行胞內導向ODN靶向攜帶識別信號的大分子載體修飾ODN與信號肽的胞內進入途徑利用肽提高膜通透性，并促進ODN的通過ODN與親脂基團耦聯或囊化進入膜載體利用鏈球菌溶血素0進行生化顯微注射以改變細胞質膜通透性配體-受體技術：ODN靶向嗜中性白細胞脂質體介導的ODN給藥聚乙烯亞胺介導的ODN給藥腦細胞給藥轉鐵蛋白受體抗體ODN結合物穿過血腦屏障（BBB）進行全身給藥腦室內給藥鞘內給藥利用可生物降解的高分子基質進行局部給藥利用可植入的給藥裝置回體技術（exvivoapproach）雖然在大多數研究中，ODN的給藥方法通常是靜脈內注射，但人們也開發出其他一些給藥方法，簡述如下：一、口服由于ODN在胃腸道的穩定性差且不易吸收，故一般認為ODN不適合用于口服。然而，含有RNA和DNA片段的第二代ODN可以口服給藥，并可通過胃腸道完全吸收。這種化合物靶向HIV-1的gag基因，是目前正在開發用于治療艾滋病的藥物之一。二、離子電滲給藥通過離子電滲療法，ODN可經小鼠乳腺腫瘤區的皮膚給藥。研究發現，ODN進入腫瘤、越過腫瘤并到達小鼠所有的器官。從腫瘤中提取的ODN經電泳分析顯示，這些化合物在整個過程中均輸送到各種組織中。三、眼睛局部給藥紫外線暴露的大鼠眼睛經c-fosODN點滴處理后可抑制角膜中c-foc表達的增高（分子機制為光損害和細胞死亡），提示這種給藥方法具有治療作用。四、特殊技術行胞內導向某些特定的大分子可被識別，并通過受體介導的內吞作用而內化，當反義ODN吸附于這些大分子，可產生特定的靶向作用并增加細胞內攝入。目前已開發的相關技術如下：（1）ODN的3’端和5’端均被替換以防止被核酸外切酶降解，并使之可與某個載體或肽連接。（2）復合糖（glycoconjugate）可用作載體。這些大分子通過提高藥物的局部濃度及藥物在胞內的濃度以增強藥效。（3）反義ODN與肽相連接，其目的在于協助ODN到達內質網，以便穿過內吞膜或囊狀腺，并進入胞質溶膠。（4）采用具有增加細胞通透性的肽來提高ODN在胞質溶膠或核內的濃度。（5）ODN與親脂基團耦聯或囊化進入膜載體。（6）限制反義藥物有效釋放的主要因素是ODN不易從內體中排出，可通過內體破裂劑增強細胞質給藥效果。五、生化顯微注射通過顯微注射直接導入細胞質的寡核苷酸快速集在細胞核中。寡核苷酸不能有效地到達指定作用部位是限制其在基因研究中的常規應用以及藥物開發的主要問題。六、配體-受體技術ODN可與各種疏水基團如膽固醇或脂質共價連接以提高細胞攝入水平。七、脂質體介導的ODN給藥脂質體能幫助ODN克服細胞不能有效攝入及其快速從體內丟失的困難。幾種類型的ODN能有效地而穩定地摻入脂質體以便持續釋放及定向給藥。經內吞作用內化的陽離子脂質翻轉（flip-flop）。陰離子脂質體擴散到復合物中，并與陽離子脂質形成離子對，從而引起陽離子脂質中ODN的移位，并釋放到細胞的質中。脂質體介導ODN給藥的優點簡述如下：（1）有利于ODN給藥，可用于治療細胞內感染如HIV-1。由于病毒芽殖而修飾的細胞膜可促發對含ODN脂質體的攝入。一方面，脂質體在細胞內可防止寡核苷酸被降解，另一方面，脂質體在細胞內的降解可使ODN到達其靶RNA并發揮反義效應。（2）循環時間長的脂質體可能有利于ODN在腫瘤組織富集。這是通過某種腫瘤的可通透性血管結構產生的被動靶向作用產生。（3）抗體靶向的脂質體可增加ODN的靶特異性。八、聚乙烯亞胺介導的ODN給藥聚乙烯亞胺（polyethylenimine,PEI）是一種可在體內和體外高效輸送寡核苷酸和質粒的載體。PEI高效性是由于其具有一種廣泛的溶酶體緩沖作用（lysosomebuffering），它即可防止DNA被核酸酶降解，又可PEI/DNA顆粒在溶酶體膨脹和破裂后得以逃逸。九、腦細胞給藥腦組織給藥需要一些特殊策略，ODN也同樣如此，這一點非常重要，尤其是當ODN用于治療惡性腦腫瘤和中樞神經系統（CNS）疾病時。全身性給予的ODN必須穿過血腦屏障（BBB）。BBB的特征如毛細血管內皮細胞間緊密連接（tightjunction）以及漸狹的液相內吞作用阻礙了細胞通過液相內吞作用對核酸的自然吸收。脂質體是克服這個困難的策略之一。ODN也可通過可生物降解的高分子基質在局部給藥。高分子裝置除了可以持續釋放ODN外，還可防止ODN在那種生物條件下被降解。這類可植入系統在治療腦腫瘤時可通過BBB。將ODN導入腦組織并穿過BBB的另一技術是采用直接注入腦脊液的途徑。十、回體技術回體基因療法中，應用反義化合物的可能性很高。在將存活細胞輸回患者體內之前，可先去除異常細胞，并將反義化合物導入干細胞中用于治療血液系統腫瘤。這種技術可避免因全身給藥而產生的毒副作用。第九節反義寡核苷酸的藥代動力學[2,3,7-11]迄今為止，PS-ODN的藥代動力學研究都依賴于放射性同位素標記示蹤分析。PS-ODN口服給藥后能被吸收，但生物利用度很低。PS-ODN經iv、ip或sc給藥后，與血漿蛋白有很高的結合率，藥物分布于除大腦以外的所有組織。由于體內廣泛存在的核酸酶，天然寡核苷酸極易被降解，故實驗中多采用修飾的寡核苷酸，以增強其核酸酶抗性。寡核苷酸的修飾方法有多種，如硫代、磷酸三酯、甲基磷酸化、a-寡核苷酸、二硫代磷酸酯、2'-修飾、2'-5'連接及肽核酸等，其中研究最深入、應用最廣泛的是硫代寡核苷酸，其具有良好的水溶性、穩定性及易于大量合成，基本上能滿足臨床治療的需要。對寡核苷酸藥代動力學的了解也基于對硫代寡核苷酸的藥代動力學的認識。研究表明，采用多種給藥途經包括皮下、皮內、靜脈及腹腔注射，除腦組織外，硫代寡核苷酸可分布全身各組織器官，主要分布于肝、腎、脾及骨髓，肝臟累積藥物的速度最快，1-2小時內累積量達用藥量的20％，同時其對藥物的清除也是最快的，肝臟清除半衰期為62小時，而腎髓質則為156小時。細胞內的分布也較廣泛，但不同類型細胞之間亞細胞分布具有明顯差異。硫代寡核苷酸血漿分布半衰期(t1/2a)<1小時，清除半衰期(t1/2b)約40-60小時，在血漿中，與血漿白蛋白及a2－巨球蛋白相結合，但其親和力較低，與其它藥物分子如青霉素及阿斯匹林等的親和力相當，這可能為硫代寡核苷酸提供了一個貯藏所，防止腎臟的快速排泄。各種組織抽提寡核苷酸分析顯示硫代寡核苷酸主要從3'端降解，也可見5'端或3'與5'端降解，另有實驗結果顯示核酸內切酶在其代謝過程中也起一定的作用。硫代寡核苷酸主要排泄途徑是經尿排泄。

一、嚙齒類藥代動力學25mer35S標記硫代寡核苷酸單次靜脈給予小鼠和大鼠，30分鐘內即可觀察到廣泛的組織分布，腎及肝組織中濃度最高，腦中濃度最低，t1/2a為0.95h，t1/2b為48h，血漿中寡核苷酸PAGE可見全長及降解片段，寡核苷酸主要以降解產物形式經尿排泄，48h內尿內排泄40％。皮下、腹腔內及真皮內注射獲得的血漿峰值濃度較靜脈注射的低，但血漿清除及組織分布模式相似。14C標記硫代寡核苷酸玻璃體內注射顯示玻璃體及視網膜的半衰期分別約為60h和90h。

二、猴體內藥代動力學硫代寡核苷酸在猴體內的吸收、分布及排泄與嚙齒類相似，靜脈注射后，血漿t1/2a為0.6-1h，t1/2b為42-56h，血漿峰值濃度和尿中排泄百分率呈劑量依賴性，靜脈內注射1mg/kg和5mg/kg，96h后尿中排泄分別約為27％和53％。

三、人體內藥代動力學針對p53mRNA的20mer硫代寡核苷酸以0.05-0.25mg/kg/h連續10日靜脈輸注17名白血病患者，血漿濃度范圍在2.1-6.4mg/L(0.32-0.97mm)，24h內達穩定狀態，同時尿中排泄60％。在HIV-1感染患者，以0.1mg/kg單次劑量輸注35S標記硫代寡核苷酸(互補于gag基因)，2h后，血漿峰值濃度達295.8ng/ml，t1/2a為0.18h，t1/2b為26.7h。PAGE分析顯示全長寡核苷酸在血漿中持續達2h，96h內尿中排泄70％，大部分為降解產物。最近，在5名白血病患者，以0.05mg/kg/h連續10日緩慢靜脈輸注硫代寡核苷酸，t1/2b為5.9-14.7日，尿中放射性回收率占總劑量30-60％，其中30％為完整藥物。采用毛細管凝膠電泳對完整藥物水平進行詳細分析顯示20mer硫代寡核苷酸以0.06-20mg/kg劑量輸注2h后檢測，血漿峰值濃度隨劑量呈線性增加，劑量為2mg/kg時，完整藥物的血漿峰值濃度為9.5mg/ml。然而，血漿中藥物的清除也呈劑量依賴性，2mg/kg劑量的清除率為1.28ml/min/kg，而0.5mg/kg劑量的清除率為2.07ml/min/kg。尿中基本上未發現完整藥物。

綜上所述，藥代動力學研究表明，硫代寡核苷酸腸道外途徑給藥，能被很好地吸收，并廣泛分布于外周組織，不透過血腦屏障，主要通過緩慢代謝而清除，1日1次或隔日1次全身用藥方案是可行的。口服給藥，生物利用度很低，<5%，主要由于腸道內降解作用所致。第十節反義寡核苷酸的毒性[2,9,10,12-14]PS-ODN的毒性表現為：凝血時間延長、補體激活和繼發致死性血液動力學變化、腎臟毒性、免疫刺激以及肝臟、血液生化的變化等。硫代寡核苷酸的體內毒性作用似乎是種屬依賴性的。迄今，小鼠急性LD50均超過500mg/kg。在嚙齒動物，多途徑給予多種硫代寡核苷酸，常見的劑量限制性毒性作用是免疫刺激，表現為淋巴組織增生，脾腫大，多器官單細胞浸潤，這些作用僅發生于劑量超過20mg/kg、長期給藥時，且呈劑量依賴性，但所有這些作用是可逆性的。長期真皮內給藥毒性作用最明顯，可能是由于局部高濃度引起局部細胞因子釋放和細胞因子瀑布的啟動。在劑量超過100mg/kg時，可見肝酶水平輕微升高及輕度血小板減少。最近，文獻報道互補于relAmRNA(NF-kB)的24mer硫代寡核苷酸腹腔注射給CD-1小鼠，每周3次，連續2周，100及150mg/kg劑量導致明顯毒性作用，甚至動物死亡，死因可能是急性腎衰，其它可見血清AST及ALT增高及嚴重血小板減少，這些改變顯示受損的組織器官與硫代寡核苷酸的主要組織分布相一致，可能與其在這些組織中長時間的累積及其代謝物有關。此外，一些實驗顯示某些毒性作用與寡核苷酸序列有關，如針對NF-kBp65起始密碼區的正義序列引起小鼠脾增大，而相同堿基構成的反義序列則無此作用。

在猴實驗中，最明顯的劑量限制性副作用是血壓降低伴心博徐緩，外周血白細胞總數及中性白細胞瞬時下降，這可能與通過旁路C5補體激活有關。所檢測的硫代寡核苷酸似乎均可誘發該作用，但不同序列或長度的寡核苷酸在作用強度方面可能存在輕微的差異。另一種明顯的毒性作用是部分活化凝血酶原激酶時間(aPTT)延長，在