抗VEGF人源化單抗2010年1月18日第一研究室梁紅遠目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/182目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/183血管內皮生長因子(VEGF)與疾病2011/1/184Avastin腫瘤轉移性結、直腸癌轉移性腎細胞癌多形性膠質母細胞瘤乳腺癌等血管內皮生長因子(VEGF)與疾病2011/1/185Lucentis眼科疾病年齡相關性視網膜病變糖尿病視網膜病變角膜移植病變等目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/186VEGF的表達與純化VEGF基因克隆VEGF蛋白表達鑒定VEGF為同源二聚體蛋白，在大腸桿菌中進行原核表達，目的蛋白為包涵體2011/1/187

DTA-VEGF8-110

表達與純化（抗原）VEGF的表達與純化VEGF165

的表達與純化純化得到的DTA-VEGF8-110

、VEGF165均能形成二聚體2011/1/188

VEGFR2胞外區在CHO細胞中與hGH融合表達

VEGFR2胞外區基因克隆VEGFR2胞外區表達與純化VEGFR2胞外區表達與純化2011/1/189hGH-VEGFR2包被ELISA板，測VEGF165與其結合活性hGH-VEGFR2與VEGF165結合活性測定VEGFR2胞外區表達與純化2011/1/1810hGH-VEGFR2與DTA-VEGF8-110結合活性測定DTA-VEGF8-110包被ELISA板，測hGH-VEGFR2與其結合活性VEGFR2胞外區表達與純化2011/1/1811目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/1812DTA-VEGF8-110抗原免疫小鼠制備單克隆抗體，獲得19株VEGF特異性的單抗，其中3株單抗有阻斷作用單抗制備競爭抑制實驗

體外篩選MAb61為IgG1亞型，親和力4.5×10-9M2011/1/1814阻斷實驗MAb61對DTA-VEGF8-110與VEGFR2結合有明顯的阻斷競爭作用

圖A:Tris-Hclbuffer組；圖B:血管內皮生長因子VEGF165(400ng)組；圖C:VEGF165(400ng)與MAb61(16μg)混合組；圖D:VEGF165(400ng)和VEGF不相關鼠源同型對照單抗MAbcontrol(16μg)組MAb61在體內對VEGF的中和作用BCAD

雞胚尿囊膜實驗2011/1/1815用A673腫瘤細胞在裸鼠背部皮下接種建立腫瘤模型，腫瘤平均大小約100mm3時裸鼠隨機分為PBS、鼠源同型對照單抗MAbcontrol及MAb61三組，每組8只裸鼠，每只裸鼠每次腹腔注射100ug單抗或等體積PBS，一周兩次，治療5次。圖A：PBS對照組；圖B：MAbcontrol對照組；圖C：MAb61治療組MAb61抗腫瘤作用

腫瘤模型2011/1/1816治療結束時MAb61組小鼠腫瘤體積相比PBS組（P＜0.001）及MAbcontrol組（P＜0.001）均有顯著性差異，PBS組與MAbcontrol組（P＞0.05）無明顯差異；MAb61組小鼠腫瘤重量相比PBS組（P＜0.05）及MAbcontrol組（P＜0.05）均有顯著性差異，PBS組與MAbcontrol組（P＞0.05）無明顯差異；腫瘤體積和重量為means±s.e.m

腫瘤模型MAb61抗體對腫瘤的抑制作用2011/1/1817目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/1818

鼠單抗可變區基因的克隆MAb61重鏈可變區PCR結果輕鏈可變區PCR結果

5’RACE

2011/1/1819嵌合抗體的表達及抗原結合活性

嵌合抗體嵌合抗體與抗原結合證明克隆得到的可變區基因正確2011/1/182024h48h72h陰性對照嵌合抗體表達水平測定（OD450）0.3050.4490.8780.158嵌合抗體抗原結合測定（OD450）0.7310.9061.2010.093Signal1與Signal2在48h、72h抗體的表達水平與Signal3比較均有顯著性差異（P＜0.001），Signal1與Signal2比較無顯著差異（P＞0.05）；Signal1為hGH信號肽，Signal2為帶有內含子的抗體信號肽，Signal3為無內含子的抗體信號肽；抗體表達濃度為mean±s.e.m。不同信號肽對抗體表達水平的影響

嵌合抗體2011/1/1821抗體人源化2011/1/1822紅色區域為重鏈CDR，綠色區域為輕鏈CDR，藍色區域為人源化位點鼠單抗可變區模型人源化單抗可變區模型MAb61VL為鼠源抗體輕鏈可變區氨基酸序列；Hum61VL為CDR移植后的抗體輕鏈可變區序列，與鼠源抗體相同的氨基酸未列出；#代表抗體CDR區；*對應的位點為選擇的點突變位點。人源化抗體輕鏈可變區序列

抗體人源化2011/1/1823抗體人源化MAb61VH為鼠源體重鏈可變區氨基酸序列；Hum61VH為CDR移植后的抗體重鏈可變區序列，與鼠源抗體相同的氨基酸未列出；#代表抗體CDR區；*對應的位點為選擇的點突變位點。人源化抗體重鏈可變區序列2011/1/1824

抗體人源化Hch：嵌合抗體重鏈；Lch：嵌合抗體輕鏈；Hhu：人源化抗體重鏈；Lhu：人源化抗體輕鏈

人源化抗體與抗原結合測定

結合實驗競爭實驗

人源化輕鏈對抗體的抗原結合能力影響較大2011/1/1825抗體人源化2011/1/1826紅色區域為重鏈CDR，綠色區域為輕鏈CDR，藍色區域為人源化位點鼠單抗可變區模型人源化單抗可變區模型

抗體人源化Hch：嵌合重鏈Lch：嵌合輕鏈Hhu：人源化重鏈Lhu：人源化輕鏈La：L58與L59雙點突變Lb：L71單點突變Lc：L58、59、71三點突變Ha：H28點突變Hb：H48點突變Hc：H66與H67雙點突變Hd：H71點突變輕鏈點突變重鏈點突變輕鏈選擇L58、L59；重鏈選擇H66、H67點突變恢復親和力2011/1/1827

抗體人源化Hch：嵌合抗體重鏈Lch：嵌合抗體輕鏈Hc：H66與H67雙點突變La：L58、L59雙點突變Ld：L58、L59及L38三點突變Le：L58、L59及L79三點突變Lf：L58、L59及L81三點突變Lg：L58、L59及L83三點突變H66、H67、L58、L59、L38位點突變后人源化抗體抗原結合能力接近嵌合抗體輕鏈點突變2011/1/1828人源化抗體抗腫瘤作用2011/1/1829A673細胞腫瘤模型體外親和力成熟

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTXXXXXXXXXATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACAAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTGTTACTGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGGCTXXXXXXXXTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（VH序列）GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTGGAGCAAGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATXXXXXXXXXAACTTGGCAGATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAACGTATTACTGTXXXXXXXXXXXXAGTAXXXXXXXXXXXTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC（VL序列）

Hotpot位點2011/1/1830體外親和力成熟突變位點2011/1/1831輕鏈突變Ser93Thr94位點；重鏈突變Gly96Tyr97位點體外親和力成熟2011/1/1832wildtype

61VLCDR3HotspotMutation大部分突變體親和力下降或喪失，部分突變體親和力有所提高體外親和力成熟2011/1/1833ProteOnXPR36蛋白相互作用陣列系統（SPR）比較相對親和力體外親和力成熟2011/1/1834ForteBio’sOctetQK（BiolayerInterferometry）比較相對親和力體外親和力成熟輕鏈突變體氨基酸WildtypeSerThr256-8HisThr256-9AsnThr256