甲苯胺藍介導的光動力對大鼠口腔感染傷口的影響

光動態治療是利用特定波長的激光激發光敏劑，并與氧結合產生具有細胞毒性的單態氧和其他活性氧成分。作為一種治療腫瘤和非腫瘤的方法，獲得了臨床認可。20世紀初期,人們就知道染料和光的聯合應用可以在體外殺死特定的微生物,現已有文獻報道:此項技術可有效地殺滅口腔病原微生物和耐藥菌株。細菌的耐藥性是院內感染的重要因素,因此大量研究致力于發掘抗感染的替代療法,例如光動力。甲苯胺藍已被證明是一種能有效對抗許多微生物及其毒性產物的光敏劑,其介導的光動力在治療局部感染中可能成為抗生素的替代方法。本研究利用甲苯胺藍介導的光動力對大鼠口腔感染創口進行處理,觀察其滅菌效果及對病損的治療作用,為臨床替代抗生素治療局部感染提供參考。1材料和方法1.1培養基和儀器Wistar大鼠(哈爾濱醫科大學附屬二院醫學實驗動物中心提供);甲苯胺藍(TB,中國上海SinopharmChemicalReagent公司用無菌蒸餾水制成1mg/mL的溶液,0.22μm濾過膜濾菌,避光保存);實驗室金黃色葡萄球菌純菌株,滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋到1010/mL濃度(哈爾濱醫科大學微生物實驗室提供);甘露醇高鹽瓊脂培養基(青島海博生物技術有限公司)。HPD7404光動力治療儀(美國,波長為635nm的半導體激光,連續輸出功率0~520mW,光纖直徑0.6mm);MT-600小型振蕩器(廣州光機電工程研發中心研制,功率<10W,調速范圍0~3000r/min)。1.2方法1.2.1進行牙斷裂操取體質量(170±10)g雄性wistar大鼠36只,氟乙烷吸入麻醉,去除上頜第一磨牙腭側牙齦及其下結締組織,建立2mm×2mm切割創口。止血后,將20μL金黃色葡萄球菌液注入創口并保持5min。普通飼料常規飼養24h后用于實驗。1.2.2-半導體激光方法使用溫度和時間感染創口模型建立后的36只大鼠隨機分為12J組(激光能量12J/cm2)、48J組(激光能量48J/cm2)2個治療組和1個對照組(無光敏劑和激光照射,局部用生理鹽水)。麻醉之后用鼠牽引器牽開口腔。創口用生理鹽水沖洗后,每個創面放置3個無菌紙尖并停留10s采集第一次細菌樣本,保存于500μL滅菌磷酸鹽緩沖液中。在兩光動力治療組的創口缺損處涂10μLTB,并避光保留10min,分別用12J/cm2和48J/cm2半導體激光以0.5cm2光斑面積照射感染創口2min。對照組只單獨用10μL生理鹽水處理創口缺損處,不用激光照射。隨后以上述同樣方法第二次采集細菌樣本。所有感染創口只治療1次,隨后觀察即刻滅菌效果及創口愈合狀況。1.2.3菌落測定和轉染兩次細菌樣本用振蕩器震蕩30s后,滅菌磷酸鹽緩沖液系列稀釋,取100μL菌液接種于甘露醇高鹽瓊脂培養基,37℃需氧培養48h,數碼照相后,用圖像處理軟件ImagePro-pus5.0進行處理并計算長出的菌落,記錄數據。1.2.4實際創客率檢測治療后大鼠每天稱重,同時在創口一側放置無菌牙周探針作參照,垂直于創面進行照相。用MATLAB7.0.1圖像處理軟件對照片中的創口面積進行處理。以照片中的牙周探針刻度的1mm長度為基準,截取1mm2面積,作為基準面積,另確定創口邊界后截取照片中創口面積,以下列公式計算實際創口面積。實際創口面積=照片中創口面積/基準面積。因為創口邊界的確定為手動完成,所以每個創口邊界各由3個有經驗的操作者確定,共截取3次取平均值。7d后注意觀察創口表面是否完全愈合,完全愈合標準為組織顏色正常,質地較韌,探診無出血。口腔數碼微距照相放大后,未見創口。1.3統計分析采用SPSS13.0軟件進行重復測量方差分析,兩兩比較用q檢驗,檢驗標準α=0.05。2結果2.1tb治療前后tb能量與菌落數之間的關系各組初始菌落平均229CFU/mL到240CFU/mL,無顯著差異(P>0.05)。光動力治療后,兩治療組菌落數與治療前相比均顯著減少(P<0.05)。對照組雖較治療前稍有減少,但無顯著差異(P>0.05)。各組治療后均未達到完全滅菌效果,其中以48J/cm2組最好,3組間有顯著性差異(P<0.05)(表1)。光能量與滅菌效果之間的關系見(圖1)。在TB濃度1mg/mL,激光能量12J/cm2時,菌落數減少約85%;而激光能量為48J/cm2時,菌落數減少約93%。不同英文字母之間比較有顯著性差異(P<0.05)實驗組中48J組滅菌率最好,平均92.64%。各組間有明顯差異,F=3373.375,P﹤0.001。2.2創傷率和愈合時間模型建立后3組創口面積均逐漸增加,到第2、3天達到高峰,但兩光動力治療組明顯低于對照組,其中48J組平均病損面積最小(P<0.05)。此后,到第7天3組創口面積均逐漸變小,其中48J組最小,對照組最大,3組間有顯著性差異(P<0.05)(圖2)。48J組在第10天有創口開始完全愈合,到13d全部動物創面均完全愈合。12J組在12d出現創口完全愈合,全部愈合時間為15d,對照組到第14天才出現創口完全愈合,全部愈合時間為18d,時間最長(圖3)。各組創口完全愈合時間有顯著性差異(P<0.05)。0d和1d各組之間無明顯差別(F=0.135,P﹥0.05);第2~7天實驗組和對照組之間均有差別(P﹤0.01)。3光動力治療口腔東北部感染的作用甲苯胺藍是一種有效對抗許多微生物及其毒性產物的光敏劑,由其介導的光動力療法在殺滅病原微生物方面有很多優勢,它能夠立刻與微生物結合,幾分鐘之內就可進行光照滅菌。不但起效快而且不需要在病損部位長時間保持較高的藥物濃度。而傳統的抗生素療法通常需要幾個小時才能發揮相同的效果。另外光動力還可以防止目標微生物產生耐藥性,因為其殺菌的機理和抗生素、消毒藥物不同,光動力對微生物殺傷的具體機制被認為是激光激發光敏劑產生的單態氧作用于細胞膜,使胞漿膜蛋白和DNA損傷。作為一種安全的光敏劑,甲苯胺藍還被用于外科腫瘤界限的確定,而且曾經作為口服藥治療急性苯胺中毒沒有發生毒性反應。甲苯胺藍還具有價格優勢,相對于其他臨床用光敏劑如光敏素(Photofrin),δ-氨基乙酰丙酸(ALA)和親脂性二氫卟酚(Ce6),要便宜得多。本研究采用甲苯胺藍濃度為1mg/mL,因為它可提供最好的殺菌效果。目前有學者開始研究光動力對某些口腔感染的治療作用,如牙周炎和種植體周圍炎等。據報道,大鼠幾種感染創口模型已經建立成功而且應用于光動力治療之中。但是光動力對口腔創口感染的治療尚未見報道,而口腔的理化環境和身體其他部位有很大區別。本研究首次證實了甲苯胺藍介導的光動力對于建立在大鼠口腔金黃色葡萄球菌感染創口的治療作用。實驗中,照射時間設定為2min(臨床上過長時間不實用),最高光能量為48J/cm2,遠低于安全劑量。在48J/cm2和TB1mg/mL組合下約93%的細菌被殺滅,取得了理想的殺菌效果。表明在較低的甲苯胺藍濃度下12J/cm2、48J/cm2光能量對口腔創口感染可提供有效的光動力殺菌效果。盡管光動力治療后,有的病損沒有停止發展,但在病變高峰時,光動力治療組病損的面積顯著小于對照組(48J組和對照組平均相差5.2mm2),在以后的時間段內,光動力治療組仍表現為更小的病損面積,而且全部愈合時間也比對照組提前(48J組提前5d)。提示:光動力治療具有促進大鼠感染創口愈合的作用。其機理可能是由于光動力介導炎癥反應或是光動力對細菌毒素的破壞作用,因為雖然許多因素均能影響感染創口的愈合,但是細菌的感染依然起著重要因素。例如Hamblin等經過光動力對小鼠感染綠膿桿菌開放創口進行治療,其中90%治療鼠存活下來。FatenGad等報道:使用聚左旋賴氨酸親脂性二氫卟酚(poly-L-lysine-Ce6)介導的光動力治療大鼠腿軟組織感染模型,治療側的愈合明顯好于非治療側。Tak-WahWong等用100μgofTB和廣譜紅光治療致命性V.vulnificus感染的創口,結果發現:即使是在感