動(dòng)物肝臟中DNA的制備掌握動(dòng)物組織總DNA的提取方法及其原理。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理要獲得純的DNA樣品，必須考慮以下幾點(diǎn)：如何選材，如何破碎組織細(xì)胞？如何除去蛋白質(zhì)？(在真核細(xì)胞內(nèi)，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式存在。因此，分離DNA時(shí)必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)。)設(shè)法除去RNA的污染防止DNA酶的降解作用選材提取動(dòng)物組織DNA，一般選擇細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎的動(dòng)物臟器，如胸腺、肝臟、脾臟、胰臟等研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，破碎細(xì)胞。這種方法溫和，適合實(shí)驗(yàn)室使用。組織搗碎器：較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過(guò)高，通常是轉(zhuǎn)10秒—20秒，停10秒—20秒，可反復(fù)多次。壓榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa的高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法，但儀器費(fèi)用較高。細(xì)胞破碎方法—機(jī)械物理法：反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。超聲波處理法：借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。使用時(shí)注意降溫，防止過(guò)熱。冷熱交替法：在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。細(xì)胞破碎方法—機(jī)械物理法有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。細(xì)胞破碎方法—化學(xué)方法脫氧核糖核蛋白抽提的方法

脫氧核糖核蛋白在濃NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.15mol／LNaCl溶液中溶解度很低，利用這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白抽提出來(lái)。除去蛋白質(zhì)的方法

用十二烷基硫酸鈉（SDS）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。用氯仿-異戊醇混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95％乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+一蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來(lái)氯仿異戊醇:氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。異戊醇作用是減少操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。純的DNA樣品的獲得為了防止DNA酶的降解，提取時(shí)可加入適量EDTA（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低DNA酶的活性加入RNA酶降解剩余的RNA，獲得純的DNA保存：將DNA于濾紙上干燥，溶于1mlTE中低溫保存(一)材料：動(dòng)物肝臟(二)試劑：

（1）0.15mol／LNaCl

（2）SSC液（3）20％SDS溶液：（4）氯仿，異戊醇：（5）95％乙醇溶液。

三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器四、實(shí)驗(yàn)步驟1．取肝勻漿9ml于離心管中，以3000r／min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清。2.沉淀加SSC液至10ml，3000r／min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清。3．在上述沉淀物中加入Tris-Hcl-NaCl至6mL，加入0.4mL25%

SDS，加0.4gNaCl(一平勺），攪拌20-30min,轉(zhuǎn)移至帶膠塞的三角瓶里，加等量的氯仿異戊醇，加塞搖10min。4.將上述液體10mL轉(zhuǎn)移到離心管，3000轉(zhuǎn)，離心10min。（離心管內(nèi)的物質(zhì)分為三層，上層為含DNA的水相層，下層為氯仿-異戊醇混合物，中間層為變性蛋白凝膠。）5.將上層液體轉(zhuǎn)移至新試管，加入兩倍體積的95%乙醇反復(fù)吹打，直到看到DNA析出。核酸提取過(guò)程中的注意事項(xiàng)1.避免過(guò)酸過(guò)堿或高溫環(huán)境，合適的T：0－4℃，pH4-92.防止機(jī)械力的切割作用，避免劇烈振蕩3.防止核酸酶的降解作用，可加入抑制劑－