白花丹參總酚酸提取物對血栓閉塞性脈管炎模型大鼠的影響

動脈硬化性鎖狀位炎（tao）是一種非動脈硬化、節段性和梗死血管疾病，主要影響小腿骨及其靜脈。病因未知，發病機制復雜，尚未確定。白花丹參SalviamiltiorrhizaBungef.albaC.Y.WuetH.W.Li為唇形科植物丹參的白花變型,主要分布在山東省境內。研究表明,白花丹參不但與丹參的化學成分基本相同,而且具有丹參所不具備的對血栓閉塞性脈管炎的獨特療效。本實驗通過觀察血栓閉塞性脈管炎模型大鼠體征及血管平滑肌和纖維組織等病理變化,以及血清中血栓素B2(TXB2)、6-酮前列腺素F1α(6-k-PGF1α)、內皮素(ET)指標的變化,探討白花丹參總酚酸提取物對血栓閉塞性脈管炎大鼠的影響,為其臨床應用提供參考。1材料表面1.1動物雄性Wistar大鼠,56只,體質量280~300g,由山東大學實驗動物中心提供,動物生產許可證:SCXK(魯)20090001。1.2藥物、試劑和試劑白花丹參總酚酸提取物,由本實驗室制備,提取物中丹酚酸B質量分數達42.5%;通塞脈片,江蘇南星藥業有限責任公司,批號110203。月桂酸,國藥集團化學試劑有限公司;TXB2、6-k-PGF1α、ET酶聯免疫試劑盒,RD公司;乙腈(色譜純)、冰乙酸(分析純)。1.3自動組織脫水機及原理LC-MS—2020液質聯用色譜儀,日本島津公司;LeicaASP300S自動組織脫水機、LeicaEG1150H石蠟包埋機、LeicaRM2235切片機,德國徠卡公司;OlympusBX51光學顯微鏡,日本Olympus公司;Bio-RadModel680酶標儀,美國伯樂公司。2方法2.1濾過、不國內取白花丹參總酚酸提取物約10mg,精密稱定,置10mL量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過。參照文獻方法,采用AgilentEclipseXDB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm),流動相A為乙腈,流動相B為0.4%醋酸水溶液,線性梯度洗脫,體積流量1.0mL/min,檢測波長288nm,進樣量10μL。2.2模型制備和給藥56只大鼠隨機分為假手術組,模型組,通塞脈片陽性對照組,白花丹參總酚酸提取物高、中、低劑量組,假手術組6只大鼠,其余各組均10只。參照文獻方法稍加改進,制備血栓閉塞性脈管炎模型:大鼠ip10%水合氯醛3mL/kg麻醉,游離股動脈,用動脈夾阻斷血流,假手術組于遠心端注入0.2mL生理鹽水,其余大鼠于動脈夾下方遠心端注入0.2mL月桂酸,各組均于注射月桂酸后15min去掉動脈夾,縫合皮膚。手術后第2天ig給藥,通塞脈片組給予通塞脈片0.66g/kg,白花丹參總酚酸提取物高、中、低劑量組分別給予白花丹參總酚酸提取物5.63、2.82、1.41g/kg(每克提取物相當于7.1g生藥量),每天給藥1次,連續給藥1周。假手術組和模型組均給予等體積生理鹽水。2.3觀察指標2.3.1病變程度分級觀察大鼠患肢皮膚顏色、溫度、有無腫脹、有無壞疽及壞疽的程度、跛行等情況。病變程度分級:I級,病變局限于趾甲部;II級,病變局限于趾部;III級,病變局限于足爪部;IV級,病變局限于膝關節以下;V級,病變發展到膝關節以上。2.3.2常規he染色送檢標本為大鼠患肢月桂酸注射處以下部位的動脈、靜脈主干,以10%福爾馬林液固定,石蠟包埋,切片,常規HE染色。光學顯微鏡(×200)觀察血管平滑肌、纖維組織病變以及動脈壁炎性細胞浸潤、纖維增生等情況。2.3.3血清txb2、6-k-pgf1和et試驗剖開大鼠腹部,下腔靜脈取血,離心,取血清。采用酶聯免疫法、按試劑盒說明測定血清中TXB2、6-k-PGF1α和ET的量。2.4統計處理數據均以表示,計數等級資料采用秩和檢驗,計量資料采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。3結果3.1紫外吸收色譜圖采用LC-UV-MS法對白花丹參總酚酸提取物的主要成分進行定性分析,所得到紫外吸收色譜圖(圖1-A)與總離子流色譜圖(圖1-B)基本一致。應用ESI-MS技術對圖中各色譜峰進行質譜掃描后得到一級質譜圖,將各色譜峰的質譜圖與文獻數據比對,鑒定白花丹參總酚酸提取物的主要成分,結果見表1。3.2對大鼠的影響假手術組大鼠無病變表現。模型組大鼠在造模后,患肢皮膚溫度降低,足爪部開始出現不同程度的蒼白、腫脹,患肢均有缺血表現,肢體青紫色加深并逐漸向上發展,出現跛行或拖曳現象,在造模1周內有部分大鼠出現肢端糜爛、潰瘍及炎癥反應、有膿液滲出、惡臭味,少數大鼠患側壞疽部分脫落,患肢的脛后肌群出現嚴重壞死。與模型組相比,通塞脈片組與白花丹參總酚酸提取物中、高劑量組大鼠的病變程度均明顯減輕(P<0.05),白花丹參總酚酸提取物低劑量組的作用則不明顯(P>0.05)。結果見表2。3.3對大鼠動脈壁的影響假手術組大鼠股動脈通暢,內膜光滑完整,無剝離和脫落現象,血管內無血栓形成,無炎性細胞浸潤。模型組大鼠股動脈內均有不同程度的血栓形成,低倍鏡下觀察可見動脈壁增厚,動脈管腔內發生血栓性閉塞,未見再通,內膜大部分脫落,外膜炎性細胞浸潤較其他組明顯,伴行靜脈內亦有血栓形成;高倍鏡下觀察可見,內皮細胞部分發生水腫、變性、壞死或脫失,有脂質細胞形成并且突進管腔。通塞脈片組與白花丹參總酚酸提取物中、高劑量組大鼠的血栓減少,管腔較規則,血管及周圍組織少量炎性細胞浸潤,炎癥反應減輕;而白花丹參總酚酸提取物低劑量組大鼠動脈壁增厚,炎性細胞浸潤及血栓形成較嚴重,并有脂質沉積。結果見圖2。3.4各組大鼠血清6-k-pgf1、txb2和et水平的比較與假手術組比較,模型組大鼠血清6-k-PGF1α水平降低(P<0.05),TXB2和ET水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,通塞脈片組及白花丹參總酚酸提取物高、中劑量組大鼠血清6-k-PGF1α水平明顯升高(P<0.05),TXB2和ET水平明顯降低(P<0.05);白花丹參總酚酸提取物低劑量組TXB2和ET水平明顯降低(P<0.05),而6-k-PGF1α改變不明顯(P>0.05)。結果見表3。4對血栓閉塞性脈管炎大鼠脂質過氧化的作用血栓閉塞性脈管炎的發病機制雖尚未完全闡明,但血管內皮細胞功能受損是其重要因素之一。ET、血栓素A2(TXA2)、前列腺素I2(PGI2)等是由血管內皮細胞直接合成、分泌或經血管內皮細胞轉化的生物活性物質,這些物質與血栓形成密切相關。內皮細胞損傷后其抗血栓形成功能降低,從而促進血栓形成,并且血管內皮細胞損傷更易造成血小板等促凝物質在此聚集,進一步加重病情。因此血管內皮細胞在血栓閉塞性脈管炎發病過程中起重要作用。血栓閉塞性脈管炎患者脂質過氧化反應劇增可能參與血管內膜損傷。丹參總酚酸提取物是從白花丹參中得到的水溶性部位,含有丹酚酸A、丹酚酸B和迷迭香酸等多酚羥基化合物。丹參總酚酸提取物具有很強的抗脂質過氧化、清除自由基、抑制白細胞黏附及減輕炎癥反應等作用,可以從內部改善血管狀況。有研究表明,丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B及丹參水溶性提取物具有抗氧化作用;原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B可抑制黏附分子的表達;丹酚酸B可通過抑制動脈粥樣硬化模型大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)等相關炎性因子的分泌,抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應,還可降低動脈粥樣硬化模型家兔血漿中TXB2和ET的水平,增加6-k-PGF1α的水平,具有明確的內皮細胞功能保護作用。本實驗發現,血栓閉塞性脈管炎模型大鼠均有病變表現,出現不同程度的血栓形成,血清中TXB2和ET水平顯著升高,6-k-PGF1α水平顯著降低。而與模型組比較,白花丹參總酚酸提取