實驗八植物基因組DNA提取實驗九、DNA的PCR擴增及其產物回收實驗十、DNA與載體的連接和轉化是基因工程中最基本的操作技術基因工程狹義：人工創造DNA分子新組合的技術（即重組DNA技術）廣義：重組DNA技術及其產業化設計和應用，包括上游技術和下游技術兩大部分。上游技術是指重組DNA技術；下游技術則涉及到基因工程菌或基因工程細胞的大規模培養以及基因表達產物的分離和純化，動、植物轉基因等DNA重組微生物發酵分離、提純產品生物反應器狹義轉基因廣義+提取DNA（8）篩選文庫/PCR（9）連接（10)載體細胞DNA載體重組載體宿主擴增（基因）酶切基因基因轉化(10)+上游技術下游基因修飾動物（假想圖）基因修飾植物（假想圖）小規模發酵大規模發酵下游技術實驗八、植物基因組DNA提取一、實驗目的了解植物基因組DNA提取的原理掌握植物基因組DNA提取的方法掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳技術掌握用紫外分光光度計測定DNA濃度的方法1.獲取細胞：研磨、勻漿……2.裂解細胞：凍融、SDS……3.分離DNA：

CTAB、苯酚……4.純化DNA

乙醇、RNA酶……二、實驗原理真核細胞的核基因組存在于細胞核內，所以提取真核基因組DNA需要先破碎細胞膜和核膜，然后分離和純化DNA。提取過程中要防止酸、堿和DNA酶對DNA的降解1.獲取細胞動物植物微生物或培養細胞液氮研缽取少量組織，速凍+離心上清(棄)沉淀(留)研磨細胞2.裂解細胞凍融能破壞細胞膜，SDS(十二烷基磺酸鈉)能破壞核膜并抑制DNA酶的活性3.分離DNA

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)與核酸形成不溶于低鹽溶液(0.3mol/LNaCl)的復合物，通過離心可除去蛋白和多糖，然后將CTAB與核酸的復合物溶解于高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)，加入乙醇使核酸沉淀，離心除去溶于乙醇中的CTAB4.純化DNA用酚氯仿抽提除去殘留蛋白質；用70%乙醇對核酸沉淀進行洗滌以除去溶于70%乙醇的NaCl等雜質；加入RNA酶以除去RNA1.材料

菠菜Spinaciaoleracea2n=122.試劑Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒。（生工公司）三、實驗材料和試劑取50-100mg組織，液氮充分研磨，并轉移至1.5ml離心管中。600ul65℃預熱的BufferPCB12ulβ-巰基乙醇65℃水浴,25-30分鐘（間或混勻）12000rpm離心5min，吸取上清至新的1.5ml離心管

（450ul)加入等體積的氯仿加入等體積的BufferBD,混勻加入等體積的無水乙醇轉移至吸附柱，靜止2min10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液加入500ulPWSolution加入500ulWashSolution10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min取出吸附柱，放入1個新的1.5ml離心管中（干燥）加入30ulTE靜止3min12000rpm離心2min取5μl電泳檢測取2μl紫外檢測-4℃或-

20℃保存標記4-1-姓名（450ul)（450ul)3次先做組織剪碎

-20℃凍結40min,用槍頭在離心管底部按壓10次左右電泳檢測23130bp9416bp6557bp4361bp2322bp2027bpλ-HindⅢdigest(1％Agarose)

取2μlDNA溶液，加滅菌水稀釋至80μl，用紫外分光光度計測定吸光值

當A260/A280≈1.8左右時，提示DNA質量良好

當A260/A280>2.0時，提示含有較多RNA

當A260/A280<1.6時，提示含有較多蛋白質濃度為1μg/μl的天然雙鏈DNA在260nm波長處的吸光值為0.020，所以：

DNA濃度(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數

紫外檢測五、注意事項1對DNA做好標記，-20℃保存

2使用離心機時必須先配平3電泳凝膠中所加的溴化乙錠(EB)有致癌性，GoldView

雖無致癌性，但其溶液酸性較強，但對皮膚和眼睛有