馬鈴薯晚疫病菌ppde對馬鈴薯葉片中多酚氧化酶和過氧化物酶活性的影響

由病毒引起的晚發(fā)性疾?。╬mp）是一種嚴(yán)重的卡其色疾病，在大多數(shù)卡其色種區(qū)廣泛傳播。在20世紀(jì)90年代中期，在中國的主要甘薯種植區(qū)，p.在植被區(qū)的條件下逐漸發(fā)現(xiàn)新的生理物種。病原體物種的快速轉(zhuǎn)變是導(dǎo)致小生物原因缺乏垂直抗生素的根本原因。水平抗性是由微效多基因控制的數(shù)量特征。雖然其抗病性低于垂直抗生素，但由于對不同的生理單胞的抗性、抗性相對穩(wěn)定、抗逆性和抗逆性，選擇晚病菌可以減少晚病的變異，因此它已成為抗晚病動物育種的方向。然而，關(guān)于晚發(fā)性pra綜合征的水平抗原性機(jī)制的研究相對滯后，這限制了在育種中確定生理和生化指標(biāo)的選擇，并限制了適當(dāng)利用抗生素資源。植物體內(nèi)酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物醌類物質(zhì)對病原物有很高的毒性,一方面可以鈍化病原菌產(chǎn)生的毒素,另一方面可能是植保素的合成前體,參與植物對病原物的生化防御體系.苯丙氨酸解氨酶(PAL)是莽草酸途徑的關(guān)鍵性酶,是酚代謝的主要酶之一,多酚氧化酶(PPO)參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生醌類和參與木質(zhì)素的合成,以抑制病原物的繁殖和在植物體內(nèi)的擴(kuò)展.多酚的氧化與過氧化物酶(POD)和PPO有關(guān),二者活性的增加可以大大增加酚氧化物的含量.本文以不含R基因的馬鈴薯晚疫病水平抗性材料和感病品種為研究對象,測定了馬鈴薯與晚疫病互作中PPO、PAL、POD、木質(zhì)素含量的動態(tài)變化,以期了解酚類物質(zhì)代謝在馬鈴薯抗晚疫病機(jī)制中的作用.1材料和方法1.1virdc1165.19水平抗性材料LBr-12,(CIPCode:387413.21,親本來源:374080.5XAVRDC1287.19)試管苗(國際馬鈴薯中心駐京辦事處謝開云先生惠贈);感病品種(Favorita)試管苗(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良實(shí)驗(yàn)室保存).1.2檢測試劑中的抗病性馬鈴薯晚疫病菌(P.infestans)為分離自甘肅省定西、渭源和臨洮等馬鈴薯主栽地區(qū)病株的混合菌株,在黑麥培養(yǎng)基上18℃培養(yǎng)備用.1.3葉片噴霧接種MS培養(yǎng)基上擴(kuò)繁的保存苗生長至4W后,移栽于塑料缽(20cm×25cm)中,18～25℃溫室中培養(yǎng).生長8W植株進(jìn)行葉片噴霧接種,游動孢子懸浮液制備參照朱杰華的方法,游動孢子濃度約為5×104個/mL,接種后用塑料膜保濕24h,以清水處理為對照.接種后0、1、2、4、6、8d取樣,選取自頂部以下第3～5葉用于酶活和木質(zhì)素含量測定.1.4pal活性測定1.4.1基乙醇緩沖液的制備參照李靖等的方法,稱取0.5g葉片,加0.05mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.8)5mL,含5mmol/L巰基乙醇和0.1g聚乙烯吡硌烷酮,冰浴研磨,10000r/min離心15min,取上清,置4℃冰箱備用.1.4.2酶活單位反應(yīng)體系為:1mL酶液加1mL0.02mol/L的L-苯丙氨酸和2mL蒸餾水,總體積為4mL,以1mL蒸餾水代替底物作為對照.30℃恒溫反應(yīng)30min后用紫外分光光度計(jì)在290nm處測定吸光值.酶活單位U定義為在290nm處吸光值變化0.01所需酶量.1.5r-ppo活性測定1.5.1聚乙烯吡烷酮的制備稱取0.5g葉片,加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.8)2.5mL,內(nèi)含0.1g聚乙烯吡硌烷酮,冰浴研磨,10000r/min離心15min,取上清液,置4℃冰箱備用.1.5.2酶活單位的測定參照李靖等的方法,反應(yīng)體系為:10μL酶液加0.02mol/L的鄰苯二酚1.5mL和0.05mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖液,1.5mL蒸餾水,總體積為3mL,以不加酶液的為對照.30℃反應(yīng)2min后在290nm波長下測定吸光值.酶活單位U定義為在398nm波長下吸光值變化0.01所需酶量.采用Bradford方法.1.6pod活性測試1.6.1酶溶液提取1.6.2酶活單位參照郝再彬等的方法,酶活性測定的反應(yīng)體系為:0.1mL的酶液加0.05mol/L磷酸緩沖液2.9mL,2%H2O21mL,0.05mol/L磷酸緩沖液1mL.以煮沸5min的酶液作對照,37℃反應(yīng)15min后,用三氯乙酸終止反應(yīng),470nm波長下測定吸光值,酶活單位U定義為在470nm波長下吸光值變化0.01所需酶量.1.7硫酸—木質(zhì)素含量測定參照波欽諾克的碘量法(略加改動),取10mL0.5N硫酸—重鉻酸鉀,加入20mL水,冷卻后與KI反應(yīng),用0.5N的硫代硫酸鈉滴定作為空白對照.2結(jié)果與分析2.1對葉片酶活性的影響接種晚疫病菌后,2個品種葉片PAL酶活性都呈先降后升趨勢(圖1),品種抗性不同,PAL酶活性被激發(fā)的程度也不同.未接種的2品種葉片在測定的時間內(nèi)酶活性變化不大,而接種后1～2d水平抗性品種和感病品種費(fèi)烏瑞它都出現(xiàn)下降,費(fèi)烏瑞它至第4d是達(dá)到峰值,為對照的1.4倍,隨后迅速下降;而LBr-12則于第4d后出現(xiàn)升高,8d時約為清水對照的2.1倍.水平抗性品種與感病品種相比,PAL酶活性雖上升晚,但上升后持續(xù)的時間較長,升高的幅度也大.2.2不同水平抗性品種ppo酶活性的比較如圖2所示,2個馬鈴薯品種未接種晚疫病菌時,PPO酶活性變化趨勢不明顯,波動范圍都不大.接種后,2個品種PPO酶活性均出現(xiàn)不同程度的提高,水平抗性品種LBr-12于接種1d后即出現(xiàn)升高,2d后略有下降,此后繼續(xù)升高,8d時活性高出對照約200%;感病品種費(fèi)烏瑞它于接種2d后PPO酶活出現(xiàn)升高,4d后達(dá)到峰值,比對照高73%,此后開始下降.2.3/7年生短劑對pod活性的影響如圖3所示,2個馬鈴薯品種清水對照的POD活性變化不明顯,水平抗性品種LBr-12的POD活性始終高于感病品種費(fèi)烏瑞它,說明LBr-12具有較高的POD基礎(chǔ)活性.接種晚疫病菌后,感病和抗病品種的POD活性都升高,水平抗性品種LBr-12于接種2d后即出現(xiàn)下降,而感病品種費(fèi)烏瑞它于接種1～2d后POD活性緩慢升高,此后持續(xù)升高,但4d后LBr-12的POD活性高于費(fèi)烏瑞它.2.4感病品種木質(zhì)素含量的變化由圖4看出,未接種的植物隨著時間變化,木質(zhì)素含量略有增加的趨勢,但變化幅度很小.接種晚疫病菌4d后,2個品種木質(zhì)素含量開始出現(xiàn)緩慢升高,感病品種費(fèi)烏瑞它接種后第6d達(dá)到峰值,為對照的1.41倍,此后保持在這一水平;水平抗性品種LBr-12接種后第6d有較大幅度增加,為對照的1.64倍,此后緩慢增長,至第8d時為清水對照的1.83倍.由此可見,抗病品種木質(zhì)素含量最大值高于感病品種的最大值.3從互作系統(tǒng)的角度抗病性不同的馬鈴薯品種接種晚疫病菌后,酚類物質(zhì)代謝相關(guān)的酶發(fā)生了明顯的變化.接種晚疫病菌混合小種后,不含有R基因的水平抗性材料葉片的PAL、PPO、POD的酶活性與感病品種相比,升高的幅度較大,而且持續(xù)的時間較長.這與陳捷等在-玉米彎孢葉斑病菌、Lojkowska等在馬鈴薯塊莖軟腐病菌、曾永三等在豇豆銹菌,陳勇勝在小麥條銹菌等在互作系統(tǒng)方面研究的結(jié)果相一致.這說明酚類物質(zhì)代謝相關(guān)的酶類,可能是植物抗病機(jī)制中的重要組分.寄主植物細(xì)胞壁木質(zhì)化可起到抗病作用已得到了普遍的公認(rèn),它具有主動抗性和被動抗性的雙重功能;它是植物細(xì)胞壁的組成成分,成為病原菌入侵的機(jī)械屏障,而且在木質(zhì)素代謝過程中產(chǎn)生的游離基還可以鈍化真菌的細(xì)胞,提高植物對病原菌的抵抗能力.本研究證實(shí),能誘導(dǎo)不同親和性互作品種木質(zhì)素的產(chǎn)生,其含量與馬鈴薯品種的抗性呈正相關(guān).可見,病菌的侵染可激發(fā)馬鈴薯固有抗性的表達(dá).研究結(jié)果還表明,木質(zhì)素含量開始增加出現(xiàn)在病原菌誘導(dǎo)馬鈴薯PAL、PPO和POD活性升高之后,而且木質(zhì)素的積累與這3種酶活性提高相一致.CuypersandHahlbrock早就在馬鈴薯與晚疫病菌?；?/p>