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文檔簡介

qRT-PCR相對定量計算詳解做完轉錄組分析之后，一般都要求做qRT-PCR來驗證二代測序得到的轉錄本的表達是否可靠。熒光定量PCR是一種相對表達定量的方法，他的計算方法有很多，常用的相對定量數據分析方法有雙標曲線法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用參照基因的ΔCt法和Pfaffl法。這里主要講解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何計算；qRT-PCR原理：以基因的cDNA為模板進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以可以定量。Ct值是什么意思呢？Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數(cycle)。qRT-PCR在擴增的時候都會有平臺期，在平臺期之前，PCR擴增就是簡單的指數增長，也就是1變2，2變4，4變8…擴增。數學形式就是2的ct次方，到了平臺期所有基因擴增的數目是一致的，而唯一有區別的則是ct值的不同。所以不難推斷出ct值越小，反應擴增到達平臺期所需循環數越少，目的基因起始含量越高。這里可以得到公式：計算-ΔΔCt在這里，我們有一個對照組，一個處理組，還有一個內參基因和目的基因，想看一下目的基因在處理組中相對與對照中的表達差異，也就是計算-ΔΔCt：數據如下：1.計算每組內參基因sgActionCt均值計算第一個Δct，即每組的待檢目的基因減去內參基因的Ct值3.計算對照CK組中Δct的均值，再用處理組的每一個Δct減去剛剛計算的對照CK組的Δct均值，得到ΔΔct（紅框框）4.相對表達量計算，也就是相對于對照組:2^-ΔΔct：不難看出這里的-ΔΔct和我們轉錄組當中的log2（foldc

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