補中益氣湯對脾胃虛證大鼠傷口愈合的影響及機制研究

傷口愈合的延遲不僅給患者帶來了痛苦，也是醫生面對的一個微妙問題。這是多因素綜合作用的結果。現代傷口愈合延遲的治療原則是傷口局部清潔和抗感染，效果不明顯。祖國醫學認為肌肉是由脾所主,則傷口不能正常愈合的原因在于“脾”功能異常。所以從“脾主肌肉”理論出發,選用補脾代表方補中益氣湯用于實驗研究。本研究通過大鼠脾氣虛模型的建立和手術傷口的制作,并用補中益氣湯進行干預,觀察傷口局部肌肉組織羥脯氨酸(Hyp)的濃度和血管內皮生長因子(VEGF),α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的相對表達量,探討補中益氣湯對傷口愈合的影響以及其作用機制,以達到對傷口愈合從脾進行論治的目的。1材料表面1.1動物或微生物指標健康SPF級SD大鼠,雌雄各半,體重(210±10)g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,動物合格證號SCXK(京)2009-0004。1.2制備成水部分補中益氣湯(由黃芪18g,炙甘草9g,人參6g,當歸3g,陳皮6g,升麻6g,柴胡6g,白術9g組成)和大黃由山西中醫學院第二中醫院提供,均常規煎煮,制備成水煎劑,質量濃度均為1g·mL-1,低溫保存備用。α-SMA小鼠抗大鼠抗體(Sigma公司),VEGF小鼠抗大鼠抗體(SantaCruz公司),HRP標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司),全蛋白抽提試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司),Hyp試劑盒(南京建成生物工程研究所)。1.3面-nd-x-xr凝膠成像系統和轉膜儀SpectraMax190全波長酶標儀(美國MD公司),GelDox-XR凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司),3k30臺式高速冷凍離心機(德國SIGMA公司),TE70PWR轉膜儀(美國Amersham公司),BS224S型電子天平(德國賽多利斯集團)。2方法2.1市場苦寒瀉下法建立氣功虛動物模型60只SD大鼠隨機分為3組:正常組、脾氣虛模型組、補中益氣湯組,各組又分為術后3d和術后7d2個亞組,各亞組10只SD大鼠。根據李東垣《脾胃論》中“苦寒之藥損其脾胃”的記載,應用苦寒瀉下法建立脾氣虛動物模型。脾氣虛模型組和補中益氣湯組SD大鼠每日灌服生大黃煎劑20g·kg-1,每天2次,連續灌胃18d。正常組SD大鼠給予等體積蒸餾水。2.2普通血藥濃度計算大鼠sd大鼠的研制項目采用最短紗制作工藝第18天SD大鼠背部剪毛,10%硫化鈉脫毛。第19天3組均制作手術傷口:術前禁食12h,以戊巴比妥鈉45mg·kg-1ip麻醉大鼠,常規消毒后于背部脊柱旁開1cm處平行脊柱做長約4cm的切口,切開皮膚深達肌層,傷口用3-0絲線縫合后用無菌紗布包扎,每日更換紗1次,至術后3d或7d。行手術切口當天起,補中益氣湯組SD大鼠每日ig7g·kg-1的補中益氣湯(按體表面積折算,相當于成人臨床用量),每天2次,連續給藥至大鼠處死之日。正常組和脾氣虛模型組SD大鼠給予等體積蒸餾水。末次灌胃6h后處死大鼠。2.3指標和方法的檢測2.3.1病例對照處理取3大組術后3,7d大鼠各10只,在戊巴比妥鈉45mg·kg-1ip麻醉下處死,取距切口兩側各0.3cm、長3.0cm肌肉樣本。液氮條件下研磨肌肉組織,取一部分粉末稱重,采用堿水解法檢測其所含的羥脯氨酸含量,具體操作參照試劑盒說明書。在波長550nm處測定吸光度(A),計算公式為:2.3.2sds-采用分離蛋白檢測蛋白質另取一部分肌肉粉末、稱重,按全蛋白抽提試劑盒提取各組肌肉組織的總蛋白,收集上清,-70℃保存備用。用Braford法測定蛋白質濃度,以此取等量蛋白質上樣用于跑SDS電泳,經過5%積層膠和12%分離膠電泳分離蛋白質。將分離后蛋白質轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2h,TBST漂洗膜3次。一抗4℃搖床孵育過夜,TBST漂洗膜3次。二抗室溫搖床孵育1h,TBST充分漂洗,加入ECL液反應顯影、曝光。用凝膠成像系統自帶軟件來定量檢測蛋白質的相對表達量,以正常組術后3d為比較基準,數據均用內參GAPDH進行標準化處理。2.4數據統計分析采用SPSS17.0統計軟件進行分析,數據均以ue0af±s表示。多組間差異比較采用單因素方差分析,P<0.05表示有統計學意義。3結果3.1大鼠一般情況灌服大黃后第2天多數大鼠泄瀉、便形質軟或溏稀,肛周紅且有污物,第3天起逐漸出現大鼠食量減少、體重減輕,懶動、蜷縮、弓背、瞇眼,喜扎堆,易驚,毛污黃無光澤、毛粘成縷狀甚至稀疏,10d以后表現出行動緩慢、嗜睡、精神萎靡、明顯消瘦、久瀉不止甚至有脫肛現象,符合脾氣虛癥。3.2模型組和補中益氣湯組hyp含量比較與正常組術后3d比較,模型組和補中益氣湯組術后3d的大鼠Hyp含量均顯著降低(P<0.01和P<0.05)。與正常組術后7d比較,模型組術后7d的Hyp含量顯著降低(P<0.01);而補中益氣湯組術后7d的Hyp含量無顯著差別。與模型組術后3d比較,補中益氣湯組術后3d的Hyp含量顯著升高(P<0.01);術后7d的補中益氣湯組較模型組相比,也呈現顯著升高(P<0.01),見表1。3.3各組大鼠血清vegf,-sma的相對表達量術后3d各組間的結果比較:與正常組比較,模型組大鼠VEGF,α-SMA相對表達量均明顯降低(均P<0.01),補中益氣湯組大鼠VEGF,α-SMA相對表達量也均顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,補中益氣湯組VEGF,α-SMA相對表達量顯著增加(P<0.01,P<0.05)。術后7d各組間的結果比較:與正常組比較,模型組VEGF,α-SMA相對表達量均明顯降低(均P<0.01),而補中益氣湯組VEGF,α-SMA相對表達量的差異均無統計學意義;與模型組比較,補中益氣湯組VEGF,α-SMA相對表達量呈現明顯增加(P<0.05,P<0.01),見圖1,表1。4補中益氣湯干預氣功虛大鼠口服愈合的作用《素問集注·五臟生成》中說“脾主運化水谷之精,以生養肌肉,故主肉”;《四圣心源》中說“肌肉者,脾土之所生也,脾氣盛則肌肉豐滿而充實”。祖國醫學認為:脾氣盛,則脾所運化的水谷精微能正常營養肌肉,肌肉才能發達、健壯;反之肌肉得不到滋養,因而可能出現傷口愈合延遲或經久不愈的現象。補中益氣湯出自李東垣《脾胃論》,當脾胃虛弱,受納和運化都不足,故應當補之,方中諸藥合用,具有補中益氣、升陽舉陷的療效。通過動物實驗研究,也已經多方面證實補中益氣湯能明顯改善脾氣虛證。在傷口愈合過程中,膠原蛋白由肉芽組織中的成纖維細胞合成和分泌,與其他成分共同作用以能修復組織的結構、改善組織的強度。除彈性蛋白含少量Hyp外,Hyp主要存在于膠原蛋白中,且含量穩定。有研究報道,大鼠組織膠原蛋白中的羥脯氨酸含量為9.2%。因此檢測組織中羥脯氨酸的含量,可以反映創傷愈合的情況。α-SMA是肌成纖維細胞的特異性標記物,只出現在正常組織的血管平滑肌細胞和肌肉組織中。在傷口愈合時,肉芽組織中豐富的肌成纖維細胞通過其細胞骨架成分α-SMA的收縮,促進傷口的收縮,皮緣靠攏,從而閉合傷口。肉芽組織中血管再生是多因素參與的過程,目前已經明確有多個血管形成刺激因子均能促進血管生成,VEGF是其中關鍵因子之一。VEGF在傷口局部的濃度明顯增高,與傷口部位肉芽組織的形成有關;其具體作用是增加傷口部位通透性、刺激血管內皮細胞分裂增殖,誘導血管生成,促進創面愈合。本研究用補中益氣湯干預脾氣虛癥大鼠的傷口愈合,實驗說明補中益氣湯通過提高Hyp,VEGF,α-SMA的量可有效促進傷口的愈合。術后3d補中益氣湯組3項指標雖然高于術后3d模型組,但是仍然低于術后3d正常組;表明用補中益氣湯干預脾氣虛大鼠3d,可促進傷口的愈合但仍