蓬亂蛋白相關形態形成活化因子-1

〔Dishevelledassociatedactivatorofmorphogenesis-1，Daam1〕

對心臟發育是必須的

報告人：唐超2021-3-19背景簡介蓬亂蛋白相關形態形成活化因子-1〔Dishevelledassociatedactivatorofmorphogenesis-1，Daam1〕，是形成素〔formin〕蛋白家族成員之一。在人體各類組織中廣泛表達。并在介導線性肌動蛋白的裝配來調節肌動蛋白細胞骨架中起著重要的作用。早期研究說明在非洲爪蟾Daam蛋白主要對原腸有重要作用(Habasetal.,2001)而果蠅中DAAM突變表現出氣管缺陷(Matuseketal.,2006).這些早期的研究結果說明，Daam1影響的組織形態。

但在哺乳動物中Daam1的生理功能迄今都了解不多作者研究發現作者發現，Daam1在小鼠發育中的器官內高效表達，包括心臟。研究使用Daam1-缺陷小鼠顯示，Daam1對于心臟形態發育是必不可少的在亞細胞水平，Daam1對于絲狀肌動蛋〔F-肌動蛋白〕組配和肌原組織以及細胞粘和定位是必須的。材料與方法一、小鼠胚胎心肌細胞和成纖維細胞培養二、RT-PCR和原位雜交三、免疫印跡—westernblot四、免疫熒光五、細胞傷口愈合試驗分析六、超聲心電圖分析七、RhoA,Rac1andCdc42結構域活性分析通過GSTpulldown技術八、用基因誘捕構建的Daam1基因缺陷的小鼠模型1、胚胎干細胞系(cellNo.:RRT390)2、帶各種篩選、報告基因的誘捕載體基因誘捕(genetrap)是基于小鼠胚胎干細胞、報道載體(誘捕載體)建立的一種基因突變方法。誘捕載體在整合位點利用內源基因調控元件模仿內源基因表達,使其表達終止。LTR報告基因，由上游啟動子起始表達；SA,剪接受體;GFNR,綠熒光硝基復原酶基因;pPKG,PKG啟動子;neo,新霉素抗性基因。基因誘捕載體系統(ROSA-GFNR)結構示意圖本文作者首先得到一個在Daam1處插入了突變型小鼠胚胎干細胞的細胞株(cellNo.:RRT390)，可以接受報告載體的整合。構建了一個lacZ及新霉素篩選位點，融合進入ES，導入C57BL/6J品系小鼠內繁殖的第一代即為基因缺陷型小鼠。結果圖A-a：基因誘捕載體示意圖圖A-b：蛋白印跡和DNA電泳圖16.5d胚胎，Het為Daam1等位基因，Mut為純合突變圖B:DNA電泳和蛋白印跡圖。16.5d胚胎各器官，Het為Daam1等位基因，Mut為純合突變1、說明Daam1基因缺陷的小鼠模型構建成功2、Daam1在小鼠各處器官均有表達Daam1在正常小鼠中的表達譜A--a-c：小鼠胚胎原位雜交檢測Daam1的表達d-e：10.5d切片分析AVC，房室墊;EC，心內膜;EPC，心外膜;圖B：8.5-10.5dDaam1在心臟和腦中PCR檢測Daam1突變小鼠中用半乳糖苷酶染色切片分析發現Daam1在小鼠全身表達，在心臟處高表達10.5d表達強烈發育的心臟和

神經管用免疫熒光染色E12.5胚胎冰凍切片。WGA：麥胚凝集素特異性染心肌細胞膜DAPI：特異性然細胞質Daam1gt/gt小鼠的心臟表型和功能特性。切片分析E14.5d、f：DORV畸形h、IVSD畸形切片分析P0d、f、h：DORV畸形j：VSD畸形2月齡Daam1小鼠的病理分析圖C：Daam1突變小鼠左心室壁出現腦回溝疏松結構〔箭頭所示〕圖D-a：心臟與身體的比重。圖D-b：超聲波心電圖分析。說明Daam1突變型小鼠LV心肌變厚。Daam1gt/gt拯救小鼠通過NKx2.5Cre小鼠與Daam1gt/gt小鼠雜交獲得Daam1拯救型小鼠。圖A：基因示意圖圖B:E10.5半乳糖苷酶染色說明拯救成功E14.5胚胎組織切片

Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+胚胎〔B，D，F〕表現出正常的心臟結構1周齡小鼠組織切片。

daam1gt/+〔A，D〕和Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+〔C，F〕小鼠表現出正常的室壁和小梁。Daam1gt/gt突變小鼠〔B，E〕顯示

心室致密。作者發現Daam1缺陷病不影響心肌細胞分化，增殖或凋亡通過Nkx2-5,Tbx20andGata4心臟早期發育基因,形態發生蛋白BMP10心室標志性基因MLC2A、MLC2V都無顯著差異表達圖A：只有Daam1gt/gt小鼠饑餓后F-肌動蛋白明顯降低表達圖B：E12.5心臟中肌動蛋白熒光分析說明，只有Daam1gt/gt小鼠肌動蛋白表達量很低以上結果說明：在心肌細胞中肌動蛋白細胞骨架的形成和橫紋肌組織的形成是需要Daam1的Daam1gt/gt小鼠在心肌細胞中橫紋肌的形成受到干擾圖A:E12.5Daam1gt/gt小鼠心肌細胞的粘附蛋白α-catenin和N-cadherin表達明顯混亂圖B：Daam1gt/gt小鼠橋粒連接異常圖C:E12.5Daam1gt/gt小鼠心肌黏接細胞排列無規那么圖D：Daam1gt/gt小鼠連接細胞變少圖d：為差異