鹽源山蛭抗凝血多肽的分離與純化

血郁病的心腦血管疾病已成為人類健康和生存的大敵。世界各國(guó)都在大力推廣人和物質(zhì)，促進(jìn)、控制和研究抗凝劑。水硫是天然抗凝劑的重要來(lái)源之一。鹽源山府是一種陸生蚱。不同來(lái)源的抗凝劑可以通過(guò)不同的方法分離和提取，離子交換層析和分子篩選凝膠過(guò)濾是分離生物因素的有效方法。在這項(xiàng)工作中，我們使用dea-c52（陰離子交換纖維）離子交換法和清熱條件海蓬（葡萄糖）的凝膠過(guò)濾方法來(lái)提取鹽源山府的抗凝劑。1材料和方法1.1凝血酶mema將鹽源山蛭斷頭,并將頭部和尾部分別立即置于液氮(-196℃)中冷凍處理后,貯于-70℃?zhèn)溆?DEAE-C52購(gòu)自美國(guó)Whatman公司;SephadexG50、凝血酶、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;凝血酶的發(fā)色底物S-2238購(gòu)自瑞典CHROMO-GENIX公司;牛血清白蛋白購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所.1.2研磨法epes取100只鹽源山蛭的頭部,置于5mLHEPES緩沖液(10mmol·L-1CaCl2,20mmol·L-1HEPES,pH7.8),于4℃研磨勻漿,后經(jīng)超聲粉碎6min,勻漿液經(jīng)8500g離心25min(4℃),收集上清液;將沉淀再次用HEPES緩沖液溶解后,8500g離心25min(4℃),將2次高速離心所獲上清液合并,經(jīng)105g超速離心60min(4℃)后棄沉淀,上清液即為粗提純的抗凝血蛋白溶液,-20℃保存?zhèn)溆?1.3deea-c32的制備將2gDEAE-C52反復(fù)懸浮于大體積的雙蒸水中,讓其自然沉降,用傾倒法除去其中的細(xì)小顆粒;用20mL0.5mol·L-1NaOH-NaCl溶液浸泡30min,后用雙蒸水洗至中性,再用20mL0.5mol·L-1HCl浸泡30min,用雙蒸水洗至中性;將洗滌后的DEAE-C52懸浮于一定量的初始緩沖液(10mmol·L-1的HEPES,并用稀HCl調(diào)節(jié)pH至7.8).先在柱內(nèi)加入約1/3柱高的HEPES緩沖液,后連續(xù)加入DEAE-C52懸浮液,利用重力沉降法裝柱,最終柱體積約為4mL.將層析柱與蛋白紫外監(jiān)測(cè)儀相連(λ=280nm),用大量HEPES緩沖液洗滌層析柱,調(diào)整蛋白紫外檢測(cè)記錄儀的靈敏度為0.2A,量程500mV,紙速6cm·h-1.將5mL粗提純的抗凝血蛋白溶液于沸水浴中加熱10min后,通過(guò)一個(gè)0.45μm濾器過(guò)濾,然后加入DEAE-C52柱內(nèi),用HEPES緩沖液沖洗未結(jié)合到柱上的蛋白,直至D流出液=DHEPES.即記錄儀記錄線回到基線;以HEPES緩沖液配制的0～2mol·L-1的NaCl進(jìn)行梯度洗脫,洗脫液共50mL,以2mL·管-1收集洗脫峰.1.4抗凝血肽的制備將1.5gSephadexG50浸泡在50mL雙蒸水中過(guò)夜,充分溶脹,并用傾倒法除去其中的細(xì)顆粒,后將SephadexG50懸浮于HEPES緩沖液中.在層析柱內(nèi)先加入約1/3柱高的HEPES緩沖液,關(guān)閉出口,在攪拌下緩慢加入凝膠懸浮液,待自然沉降約1～2cm后,打開(kāi)出口,繼續(xù)加入凝膠懸浮液直至所需高度為止,并在膠面上加一個(gè)紗墊以保護(hù)膠面,最終柱體積約為18mL.將凝膠過(guò)濾層析柱與蛋白紫外監(jiān)測(cè)儀相連(λ=280nm),調(diào)整蛋白紫外檢測(cè)記錄儀為靈敏度0.2A,量程200mV,紙速20cm·h-1.將由DEAE-C52離子交換層析分離獲得的抗凝血肽樣品經(jīng)冷凍干燥后溶于500～1000μLHEPES緩沖液,取300μL上樣,待樣品進(jìn)入凝膠床后,緩慢加入HEPES緩沖液,洗脫并收集洗脫峰.1.5凝血酶抑制劑用量的確定抗凝血肽抑制凝血酶的活性參照文獻(xiàn)的方法測(cè)定并做了適當(dāng)改進(jìn).在酶標(biāo)盤(pán)各孔中順序加入10μL凝血酶(10U·mL-1),10μL待測(cè)樣品,150μL測(cè)活緩沖液(0.1mol·L-1Tris,0.2mol·L-1NaCl,w=2%PEG-8000,w=2%BSA,pH8.2);以雙蒸水為空白,以凝血酶+HEPES為對(duì)照,37℃保溫15min;在各孔中加入凝血酶底物4mmol·L-1S-223810μL,37℃保溫15min后,用HAc5μL終止反應(yīng);在酶標(biāo)分光光度計(jì)λ=405nm測(cè)定光吸收.根據(jù)酶活性抑制曲線計(jì)算各樣品的抑制凝血酶活性.1.6抗凝血肽質(zhì)量濃度的測(cè)定配制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為:0.25,0.50,0.75,1.00,1.25mg·mL-1.用2mL石英比色皿在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的D280,以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),D280為縱坐標(biāo),繪制蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.將各步純化的抗凝血肽作適當(dāng)稀釋后,測(cè)定其D280,根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各步純化抗凝血肽的質(zhì)量濃度.1.7抗凝劑的比活性根據(jù)各步純化的抗凝血肽的活性和質(zhì)量濃度,計(jì)算各步純化的抗凝血肽的比活性.2結(jié)果與討論2.1洗脫時(shí)cnacl鹽源山蛭DEAE-C52離子交換層析洗脫曲線見(jiàn)圖1.由圖可見(jiàn),洗脫曲線出現(xiàn)2個(gè)洗脫峰,第1個(gè)峰位于收集的第4～6管,洗脫時(shí)c(NaCl)為0.4～0.6mol·L-1;第2個(gè)峰位于收集的第13～16管,洗脫時(shí)c(NaCl)為1.3～1.6mol·L-1.這說(shuō)明抗凝血蛋白粗提純液經(jīng)DEAE-C52離子交換層析后被分成了兩大組分,這2個(gè)組分是在洗脫液中NaCl濃度不同的情況下被洗脫的,這是由于粗提純液中蛋白質(zhì)組分的生化特性的差異而導(dǎo)致與DEAE-C52的吸附能力不同所造成的.2.2抗凝血蛋白的測(cè)定抗凝血蛋白粗提取物經(jīng)DEAE-C52離子交換層析后各管收集物的抗凝血酶活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.其中第13～16管洗脫收集物的A405顯著低于對(duì)照緩沖液的,說(shuō)明凝血酶的活性被顯著抑制,即抗凝血蛋白存在于第2個(gè)洗脫峰中,由于第4～7管收集物的A405與對(duì)照緩沖液的基本相同,不具有抑制凝血酶的活性,因而不含有抗凝血蛋白.2.3抗凝血蛋白的洗脫曲線由DEAE-C52離子交換層析所獲得的含有抗凝血蛋白的洗脫液經(jīng)SephadexG50凝膠過(guò)濾的洗脫曲線見(jiàn)圖2.由圖可見(jiàn),洗脫曲線出現(xiàn)2個(gè)洗脫峰,說(shuō)明抗凝血蛋白粗提液經(jīng)DEAE-C52離子交換層析后所獲得的具有抗凝血酶活性的組分中含有分子大小不同的2類蛋白質(zhì),分子較大的一類蛋白質(zhì)被先洗脫下來(lái),即第1個(gè)洗脫峰,分子較小的一類蛋白質(zhì)則被后洗脫下來(lái),即第2個(gè)洗脫峰.2.4凝血蛋白測(cè)定經(jīng)SephadexG50凝膠過(guò)濾所獲得的各部分收集物的抗凝血酶活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.其中第5～7管收集物的A405顯著低于對(duì)照的,說(shuō)明凝血酶活性被顯著抑制,即抗凝血蛋白的存在,第2～4管收集物的A405與對(duì)照緩沖液的基本一致,不具有抑制凝血酶的活性,因而不含有抗凝血蛋白.2.5抗凝血蛋白的分離純化抗凝血蛋白純化過(guò)程中各步驟產(chǎn)物的蛋白的質(zhì)量濃度ρ蛋白、抗凝血酶活性a和抗凝血酶的比活性am的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.由表3看出,隨著純化步驟的深入,所獲得的具有抗凝血酶活性的產(chǎn)物的ρ蛋白明顯降低,粗提取物的ρ蛋白是DEAD-C52離子交換層析產(chǎn)物的7.62倍,是SephadexG50凝膠過(guò)濾產(chǎn)物的24.63倍,而抗凝血酶的am卻明顯上升,SephadexG50凝膠過(guò)濾產(chǎn)物的抗凝血酶am是DEAE-C52離子交換層析產(chǎn)物的4.26倍,是粗提取液的29.10倍.說(shuō)明抗凝血蛋白粗提取物經(jīng)過(guò)DEAE-C52離子交換層