雌激素對絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞op-hbmscsich信號通路的影響

骨質疏松癥是一種以骨量少為特征的系統性疾病，骨的微觀結構破壞，骨的脆弱增加，容易發生骨折。骨質疏松癥的發病機制仍不明確。雌激素缺乏是絕經后婦女骨質疏松癥發生的重要原因。相關研究表明,給予雌激素替代療法的絕經后婦女,發生因骨質疏松癥導致的骨折概率明顯下降。骨質疏松癥患者骨髓中脂肪細胞和松質骨的骨量呈反比,骨質疏松癥可能是骨髓間充質干細胞分化失衡后過多向脂肪細胞分化所致。前期研究表明,雌激素可以通過雌激素受體α或者激活Wnt/β-Catenin信號通路改善人骨髓間充質干細胞成骨分化的能力。盡管如此,雌激素治療絕經后骨質疏松癥以及調節骨髓間充質干細胞成骨分化的相關機制仍然不詳。Notch信號通路在細胞分化潛能、細胞自我更新能力以及凋亡過程中是一個高度保守的信號通路。目前對于雌激素與Notch信號通路的研究主要集中在人類腫瘤以及大腦發育的研究。人骨髓間充質干細胞的分化過程中,雌激素是否仍然通過影響Notch信號通路對分化及增殖產生影響的研究相對缺乏。本研究通過觀察Notch信號通路在人骨髓間充質干細胞增殖及分化過程以及在絕經后骨質疏松癥發病過程中的作用,以期進一步探討雌激素調控人骨髓間充質干細胞功能的具體機制。材料和方法知情同意書的簽署本研究經第四軍醫大學倫理委員會批準(批準號:20110405-5),所有受試者(無感染性疾病、無血液系統疾病的健康志愿者和絕經后骨質疏松骨折患者)均簽署知情同意書。患者骨髓來源無菌收集術中切除的椎骨骨髓;骨髓穿刺獲得的髂骨內骨髓;長骨骨干骨折時干骺端的紅骨髓;髖關節置換術擴髓時的紅骨髓;髂骨移植手術時,患者髂骨松質骨內骨髓。本實驗所用骨髓分別來自4名健康女性骨髓穿刺的髂骨內骨髓(年齡<35歲)和4名患有絕經后骨質疏松癥并發生股骨頸骨折行髖關節置換術時所取的髂骨內骨髓(年齡>75歲)。納入標準:根據世界衛生組織(WHO)的診斷標準:絕經后骨質疏松癥患者標準:>65歲,T值<-2.5SD,血清鈣、磷、堿性磷酸酶,Ⅰ型膠原羧基末端肽,尿中鈣排泄率等檢查指標排除繼發性骨質疏松癥。健康女性標準:<35歲,T值>-2SD,無骨折史。排除可能存在的骨代謝疾病,無服用可能影響骨骼或鈣磷代謝的藥物史。試劑與pcrFicoll細胞分離液、DMEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸、吲哚美辛、IBMX、胰島素、雌激素均購自美國Sigma公司;BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物公司;RNA提取試劑盒購自美國Omega公司;SYBRue5f8PrimeScriptTMRT-PCRKit購自日本Takara公司;iQ5RealTimePCRDetectionSystem為美國Bio-Rad公司;基因引物由上海生工生物公司合成。細胞培養液lm-2m采用密度梯度離心法進行人骨髓間充質干細胞的分離。步驟如下:用20mL注射器吸取5~10mL髂骨松質骨骨髓,用0.5mL稀釋的2500U/mL肝素鈉清洗注射器。將無菌肝素化骨髓5~10mL與等體積培養基于離心管內充分混合,1000r/min離心5min。離心結束可見試管內混合物分為3層,從上至下分別為脂肪層、血清層及血液沉積層。用吸管吸取脂肪層和血清層,將血液沉積層吸出后貼壁緩慢注入已預置等體積Ficoll細胞分離液的試管內,使兩者間形成清晰界面,2500r/min離心25min。用滴管抽出中間乳白色云霧狀單核細胞層,置于無菌離心管內,用PBS緩沖液充分漂洗(800r/min離心5min)3次,棄上清。重懸于加入含10%FBS及100U/mL青鏈霉素的DMEM-低糖培養液中,以6×103/cm2細胞密度接種于25cm2培養基。靜止置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中,3d后全量換液,棄未貼壁細胞,以后每3d全量換液一次。待細胞匯合成單層后加入0.25%胰酶消化,按照1∶2比例進行傳代接種培養(第一代,P1),待培養到P3代用于后續實驗。免疫組織化學法檢測細胞抗體檢測取第3代生長良好原代人骨髓間充質干細胞,用胰酶消化后,用PBS沖洗,離心。將細胞在離心管中重懸于100μLPBS中,每個離心管細胞數為106個。將細胞分為以下5組:空白對照組;1μLCD34-FITC組;CD44-FITC組;CD45-FITC組;CD105-鼠抗人異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)進行抗體染色組。將上述各組細胞4℃放置30min,用PBS沖洗一遍,離心,棄上清,加入1mLPBS重懸細胞行流式細胞分析。細胞分離、制備分別取健康女性與絕經后骨質疏松婦女P3骨髓間充質干細胞,用0.25%胰酶常規消化細胞,離心收集細胞沉淀,重懸細胞,以104個/孔接種于96孔板中,隔日換液。在第1、2、3、4、5、6和7天取出96孔板,每孔加入MTT20μL,37℃孵育4h后,棄孔內上清,每孔加入100μLDMSO,室溫下震蕩10min,使結晶完全溶解。在酶聯免疫分析儀上,選擇波長490nm測定吸光度值。細胞常規培養取絕經后骨質疏松癥患者P3細胞,用0.25%胰酶常規消化細胞,離心收集細胞沉淀,重懸細胞,并以105個/孔的細胞密度接種于6孔板進行常規培養。隔日觀察細胞,待細胞生長融合至30%,將細胞置以下2種培養基:正常對照組(A),雌激素共培養組(17β-Estradiol,10-7mol/L)(B)。隔日更換相關培養基。培養7d后檢測Notch信號通路關鍵分子表達情況。細胞密度接種取P3細胞1瓶,用0.25%胰酶常規消化細胞,離心收集細胞沉淀,重懸細胞,并以105個/孔的細胞密度接種于6孔板進行常規培養。隔日觀察細胞,待細胞生長融合至60%,用成骨誘導培養基(地塞米松100nmol/L、L-抗壞血酸50mmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L)替代正常培養基,進行成骨誘導。細胞密度接種取P3細胞1瓶,用0.25%胰酶常規消化細胞,離心收集細胞沉淀,重懸細胞,并以105個/孔的細胞密度接種于6孔板進行常規培養。隔日觀察細胞,待細胞生長融合至60%,用成脂誘導培養基(吲哚美辛200μmol/L、IBMX0.05mmol/L、胰島素10μg、地塞米松1μmol/L)替代正常的培養基,進行成脂誘導。堿性磷酸酯酶顯色法細胞成骨誘導7d后,PBS沖洗3遍,4℃多聚甲醛固定30min,PBS洗3遍,每次5min,用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進行堿性磷酸酶顯色。按試劑盒說明書配制染色液。PBS洗后,加入適量已配制好的BCIP/NBT染色液,以剛好可以鋪蓋細胞表面為準。37℃避光保存30min。去除BCIP/NBT染色液,用PBS清洗3遍終止染色,拍照觀察。細胞表面鋪蓋細胞成脂誘導10d后,PBS沖洗3遍,4℃多聚甲醛固定30min,PBS再洗3遍,每次5min。按照油紅∶去離子水=3∶2的比例稀釋油紅儲存液,濾紙過濾,室溫放置10min。將稀釋好的油紅染色液加入培養板,以剛好可以鋪蓋細胞表面為準。室溫保存15min后,用蒸餾水清洗3遍終止消化,顯微鏡下觀察并拍照。-ctrt-pcr方法的開發采用SYBRGreenⅠ進行相對定量分析基因表達,實驗按照2-ΔΔCt解析法進行設計,引物由上海生工生物工程公司合成,引物見表1,實時定量PCR反應體系見表2,實時定量PCR反應程序見表3,采用2-ΔΔCt值法對于RT-PCR結果進行分析。anoa分析采用SPSS17.0統計學分析軟件進行ANOVA分析。采用獨立樣本t檢驗,數據用ue0af±s表示,P<0.05表示差異有統計學意義。結果胞型成纖維細胞形態采用密度梯度離心法分別培養健康女性及絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞。可見健康女性骨髓間充質干細胞為典型成纖維細胞形態,呈紡錘形,細胞密度較大,呈集落樣生長,邊緣清楚。而絕經后骨質疏松組來源的骨髓間充質干細胞形態寬大扁平,呈單個樣生長,形態不規則,分散生長,細胞數量少(圖1)。MTT結果顯示絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞增殖能力較低(P<0.01)(圖2)。alp染色及油紅o染色的誘導成骨、成脂方向分化將第3代骨髓間充質干細胞成骨誘導7d、成脂誘導10d后分別進行ALP染色及油紅O染色,發現其誘導成骨、成脂方向分化(圖3)。流式細胞術鑒定根據骨髓間充質干細胞表面標記分子表達分別為CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD105(+)的特征,采用流式細胞儀進行分子表型鑒定的結果表明,培養細胞骨髓間充質干細胞CD44、CD105陽性率>95%;CD34、CD45陽性率<5%(圖4)。兩組etch信號通路關鍵分子表達水平比較絕經后骨質疏松患者hBMSCs中Notch信號通路關鍵分子表達水平較正常組降低,差異有統計學意義(P<0.01,n=4)(圖5)。治療骨髓間充質干細胞中etp信號通路活性的變化對絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞給予雌激素刺激,與未給與雌激素刺激的絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞相比,發現前者Notch信號通路活性增加(圖6)。即雌激素可升高絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞中減弱的Notch信號通路活性。髓間充質干細胞分化前后etch信號通路活性的變化在骨髓間充質干細胞處于未分化狀態時,雌激素可提高Notch信號通路活性。在骨髓間充質干細胞分化的關鍵時間點(3、7、14d),在骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化以及成脂分化成熟的過程中,雌激素刺激組與未給與雌激素刺激組相比,發現Notch信號通路活性均增高(圖7、8)。激素對小鼠血清中酸性磷酸酶的影響將絕經后骨髓間充質干細胞與雌激素共培養,在成骨誘導7d時進行堿性磷酸酶染色,可見雌激素刺激組堿性磷酸酶染色較深,堿性磷酸酶密度較大;成脂誘導第8天進行油紅O染色,可見雌激素刺激組脂滴染色較淺,密度較低。根據以上結果表明雌激素可促進絕經后骨髓間充質干細胞成骨分化,但抑制成脂分化(圖9)。引導人骨髓間充質干細胞激活作用骨髓間充質干細胞具有多向分化的能力,通過成骨誘導和成脂誘導及ALP和油紅O染色均可證明其分化潛能。本研究根據骨髓間充質干細胞表面表達黏附分子CD44和CD105,不表達存在于造血干細胞前體的CD34和CD45的特性,采用流式細胞儀對分離細胞進行鑒定,證實可培養出純度較高的人骨髓間充質干細胞。Notch1信號通路在人骨髓間充質干細胞分化為神經元細胞中發揮重要作用。有文獻報道Notch1介導的信號通路是決定骨髓間充質干細胞分化潛能的重要影響因素。本實驗比較了絕經后骨質疏松癥與健康女性骨髓間充質干細胞Notch1信號通路關鍵信號分子Notch1、Jagged1和Hes1的表達情況,發現上述關鍵信號分子在絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞的表達明顯低于正常組,差異有統計學意義(P<0.01)。已有文獻報道,骨質疏松患者骨髓間充質干細胞增殖能力和分化能力均有所降低,本實驗結果與其一致。由此推測,Notch信號通路的減弱與絕經后骨質疏松癥患者骨髓間充質干細胞減弱增殖能力及分化能力有關,可能是導致絕經后骨質疏松癥患者骨量降低的原因之一。本實驗證實,雌激素可以逆轉絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞已減弱的Notch信號通路關鍵分子的表達,使用雌激素干預絕經后骨質疏松患者骨髓間充質干細胞后,受體Notch1與配體Jagged1表達均升高,Hes1也顯著升高。提示雌激素與Notch信號通路間可能存在一定聯系。在人骨髓間充質干細胞成骨、成脂分化過程中給予雌激素刺激,發現在成骨分化的早期以及成脂分化的過程中,Notch信號通路關鍵分子表達較未給予雌激素刺激組均增高。圖7表明,在