流式細胞術分選嗜堿性粒細胞的研究

近年來的結果表明，嗜堿顆粒在過敏反應中發揮著重要作用，是過敏炎癥的作者和傳播者。嗜堿性粒細胞占外周血白細胞的小部分(<1%),提純一定數量的嗜堿性粒細胞就需要較多的血,這限制了對它的深入研究。臍帶血的血量較多,可得到50～150mL的量,并且臍帶靜脈血相當于新生兒血。本文采用流式細胞術分選提純產婦臍帶血嗜堿性粒細胞,以期得到研究過敏性疾病發病機制的理想標本。1材料和方法1.1資產采集,采集帶血新生兒娩出后,用血管鉗鉗夾離嬰兒端約3cm處的臍帶,將針頭插入臍靜脈,抽取臍帶血,于產后10min內采集完畢。共收集足月產婦臍帶血6份。1.2細胞數據的提取臍血每10mL加1mL0.1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑抗凝,按5∶1的比例加入6%葡聚糖,混勻,37℃水浴30min,沉淀紅細胞,吸出含豐富白細胞的上清液,離心,用含10mmol/LEDTA、pH值為7.2的0.01mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次,懸浮細胞。1.3胺及含融資日白的制備試管中依次加入1.065g/mLFicoll-泛影葡胺及上述白細胞混懸液各4mL,4℃離心30min。離心后吸出上層細胞,用含10mmol/LEDTA、pH值為7.2的0.01mmol/L的PBS洗2次。1.4fcr熒光微球檢測細胞形態密度梯度離心所得的細胞加入PBS、EDTA和0.5%BSA,在4℃的環境中放置20min。每1×107個細胞中加入80μLPBS、EDTA和牛血清白蛋白試劑(BSA),20μLFc受體阻斷試劑(FcRBlockingResgent),10μLCD203c-PE和10mLCD45-PerCP免疫熒光抗體標記20min。分離前用Flow-Check熒光微球校準儀器,標本上機后,以前向角散射光(forwardscatter,FSC)和側向角散射光(sidescatter,SSC)參數觀察細胞形態,選取SSC低信號細胞。CD203c-PE+、CD45-PerCPint的細胞即為嗜堿性粒細胞。1.5愛酸性粒細胞染色的計算細胞經阿利新藍染色并計數,統計其純度及回收率。細胞經臺盼藍染色,觀察其活性。2嗜堿性細胞純度臍帶血葡聚糖沉淀紅細胞后嗜堿性粒細胞純度為(0.26±0.17)%,細胞回收率為(90.08±1.04)%。經Ficoll-泛影葡胺分離后嗜堿性粒細胞純度為(2.97±0.36)%,細胞回收率為(75.43±1.99)%。流式細胞術分選后嗜堿性粒細胞純度為(95.02±2.94)%,回收率為(61.42±5.95)%。見表1。臺盼藍染色顯示細胞活性為(99.24±0.57)%。3因子分析方法步驟由于嗜堿性粒細胞在血中所占比例低,且缺乏令人滿意的純化方法,故在很大程度上束縛了對它的深入研究。許多研究都利用細胞株KU812,它最先是從慢性髓性白血病患者中獲取并建立起來的。KU812是一種未成熟的嗜堿性粒細胞前體,被作為嗜堿性粒細胞分化的模型。有研究表明,IgE并不能誘導KU812的細胞內信號發生,如酪氨酸磷酸化和鈣離子釋放。Aumüller等發現,嗜堿性粒細胞釋放白細胞介素(IL)-4的活性在很大程度上受儲存條件的影響,因為它與人原始嗜堿性粒細胞的形態和功能有根本的區別,故細胞株KU812不適用于過敏反應啟動機制的研究。臍帶血中的免疫細胞尚未直接受到外界過敏原的刺激,是研究過敏反應啟動機制的較好材料。臍帶血成分較外周血復雜,有未成熟的細胞,其表面標志可能不同于成熟細胞,所以臍帶血細胞的純化方法可能不同于外周血。采用磁珠負性選擇和密度梯度離心相結合的純化方法,從外周血可以得到高純度的嗜堿性粒細胞。國外資料顯示,嗜堿性粒細胞的純度為(97.60±3.96)%,回收率為(49.7±15.6%)。此外還有去除紅細胞后用磁珠負選法,Gibbs等得到的嗜堿性粒細胞純度為(99.34±0.88)%,回收率為75.6%。但這些方法對臍帶血中嗜堿性粒細胞的純化效果沒有外周血理想,因為臍帶血成分不同于外周血,有較多的未成熟的細胞,負性選擇可能得到不少雜細胞。在分離嗜堿性粒細胞的試劑盒中有人類白細胞抗原(HLA)-DR基因分型試劑(HLA-DR)抗體,外周血嗜堿性粒細胞HLA-DR是陰性的;而臍帶血有未成熟的嗜堿性粒細胞,其HLA-DR是陽性的,約占總嗜堿性粒細胞數的59%,采用此方法將丟失這部分細胞,降低回收率。我們曾用抗凝臍血30～50mL,先以6%葡聚糖沉淀紅細胞,獲取白細胞,進而用Ficol1-Hypaque作密度梯度離心獲得3層細胞,上層即為初步純化的嗜堿性粒細胞,最后采用結合CD2+、CD14+、CD16+和CD19+單抗的免疫磁珠,通過陰性選擇方式純化嗜堿性粒細胞,其平均純度為75.8%,回收率為81.5%。Reimer等用IL-3刺激培養臍帶血21d,誘導未成熟嗜堿性粒細胞成熟,再通過兩步法磁珠負選,得到臍帶血嗜堿性粒細胞的純度為(95.0±0.5)%,回收率為(59.0±1.5)%,但操作耗時復雜。這就期望建立簡便的方法來獲得臍帶血中高純度、高回收率的嗜堿性粒細胞。有學者曾用流式細胞術選取CD123+HLA-DR-的細胞即為嗜堿性粒細胞,但這也是用于外周血。而在臍帶血中有未成熟的嗜堿性粒細胞,使用此方法將丟失這部分HLA-DR+細胞,回收率降低約35%。還有作者提出先用磁珠分選去除其他細胞,提高嗜堿性粒細胞的比例后,再用流式細胞術分選。理論上結合了兩種分選法可以得到更好的結果,Willheim等取350～450mL外周血用1.077Ficoll-Pague初分后,采用免疫磁珠負選法去除CD14+的細胞,再用流式細胞術分選CDw17+CD14-的細胞即為嗜堿性粒細胞,純度為(99.5±0.4)%,但回收率僅為8%～25%。近期文獻未見結合兩種方法來純化嗜堿性粒細胞的報道,這可能是去除了絕大多數的陰性細胞,反而在用流式細胞術分選時缺乏參照而難以定位。CD203c是新近發現的嗜堿性粒細胞的表面標志,它也可表達在未成熟嗜堿性粒細胞、未成熟和成熟的肥大細胞表面。臍帶血中可能會存在肥大細胞,而肥大細胞因與嗜堿性粒細胞的生理功能相似,故需要去除,以免影響實驗結果。由于肥大細胞不表達CD45,因此分選CD203c-PE+、CD45-PerCPint的細胞即為嗜堿性粒細胞。國內外至今尚未見以此法純化臍帶血中嗜堿性粒細胞