生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告實(shí)驗(yàn)六SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一、研究背景電泳技術(shù)的發(fā)明是人們?cè)诜蛛x純化技術(shù)中的“差異轉(zhuǎn)換”思路上一次偉大的飛躍，在實(shí)際應(yīng)用的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)了它在大量樣品純化上的劣勢(shì)以及分析上的突出優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)行“揚(yáng)長(zhǎng)避短”，最終將其作為生物大分子分離鑒定的常用技術(shù)而被保留與發(fā)展下來(lái)。自電泳技術(shù)發(fā)明以來(lái)，生命科學(xué)領(lǐng)域迅猛發(fā)展，人們對(duì)生物大分子的研究不能僅僅停留在分離、純化、鑒定這些宏觀操作上，需要確定它們的分子量進(jìn)行更加深入的研究，所以迫切需要一種新技術(shù)能夠測(cè)定像蛋白質(zhì)這樣的生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量。人們又把目光轉(zhuǎn)移到迅猛發(fā)展的電泳技術(shù)上來(lái)，試著去尋找突破口。在之前的非變性電泳技術(shù)中，生物大分子得以分離的基礎(chǔ)是基于三方面的差異，即分子質(zhì)量、分子大小與形狀、電荷性質(zhì)。如果要測(cè)定種生物大分子的分子質(zhì)量，直接測(cè)定難度很大，這就需要首先找到一個(gè)參照標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)蛋白），在待測(cè)蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白之間進(jìn)行“差異縮小”，將他們?cè)陔妶?chǎng)中泳動(dòng)速度的大小僅僅體現(xiàn)為分子量上的差異，再通過(guò)尋求某種線性關(guān)系就能得到蛋白質(zhì)樣品的分子質(zhì)量。此外，人為地借助其他物質(zhì)處理來(lái)縮小這些差異也就意味著破壞蛋白質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)，變性電泳便成了必然。這一步是整個(gè)技術(shù)的核心，也是最難的突破的。1967年，Shapiro年首次報(bào)告了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)，根據(jù)他對(duì)11種蛋白質(zhì)電泳獲得的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)（或亞基）分子量的對(duì)數(shù)與蛋白質(zhì)分子的遷移率之間有直線關(guān)系。隨后，Weber等人進(jìn)行深入研究，肯定了Shapiro的發(fā)現(xiàn)，確立了以連續(xù)的磷酸鹽系統(tǒng)作為電極緩沖系統(tǒng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的新方法。后來(lái)，Laemmli將SDS電泳和Davis的不連續(xù)盤(pán)狀電泳結(jié)合起來(lái)，設(shè)計(jì)出了不連續(xù)的SDS-Tris-甘氨酸系統(tǒng)。[1]由于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有分辨率高、重復(fù)性好、微量、設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉和操作容易、迅速等優(yōu)點(diǎn)，因而得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，目前已成為蛋白質(zhì)研究的有力工具，廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、病理學(xué)、微生物學(xué)和植物生理學(xué)等學(xué)科的研究中。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tris-甘氨酸系統(tǒng)）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，體會(huì)學(xué)習(xí)這一技術(shù)的發(fā)明歷程、原理及操作。二、研究目標(biāo)1.體會(huì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的發(fā)明歷程；2.進(jìn)一步學(xué)習(xí)和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理與方法；3.學(xué)習(xí)和應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。三、研究策略1.同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行處理，消除他們?cè)谛螤钜约半姾闪可系牟町悾瑑H剩下分子量的差異；2.將處理后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白在相同條件下進(jìn)行電泳，他們的遷移速度不同，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，會(huì)體現(xiàn)出遷移距離上的差異。3.分析相對(duì)遷移率和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系，作出圖像，計(jì)算樣品蛋白的相對(duì)遷移率，從圖像上直接得出它的分子質(zhì)量。四、研究方案及可行性分析1.研究方案SDS（十二烷基硫酸鈉，sodiumdodecylsulfate）是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它以其疏水基和蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合，形成牢固的帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。SDS和蛋白質(zhì)的結(jié)合是高密度的，其重量比通常為1.4:1，由于這種高密度的結(jié)合，新引入的凈電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的凈電荷，從而消除或極大地降低了不同蛋白質(zhì)分子之間原有凈電荷的差異，即消除了由于各種蛋白質(zhì)所帶凈電荷的不同對(duì)電泳遷移率的影響。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有均一的電荷密度、相同的荷質(zhì)比。據(jù)流體力學(xué)等方面的研究推測(cè)，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈緊密的橢圓形或棒狀結(jié)構(gòu)，棒的短軸是恒定的，在18A的數(shù)量級(jí)，與蛋白質(zhì)的種類(lèi)無(wú)關(guān)；棒的長(zhǎng)軸是變化的，而且與蛋白質(zhì)的分子量成正比。這就是說(shuō)，SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后所形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，消除了由于天然蛋白質(zhì)分子形狀的不同對(duì)電泳遷移率的影響。帶電分子電泳遷移率的大小取決于三個(gè)方面，即帶電荷的多少、分子量的大小和分子的形狀。根據(jù)上面的分析，SDS作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使其電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，因而可以通過(guò)比較未知分子量的蛋白質(zhì)和已知分子量的蛋白質(zhì)分子的遷移率，測(cè)定出未知蛋白質(zhì)的分子量。2.可行性分析從基本的實(shí)驗(yàn)原理、到研究方案和具體操作，再考慮實(shí)驗(yàn)器材和時(shí)間等因素，本實(shí)驗(yàn)均有較大的可行性。在具體操作中需要注意以下問(wèn)題：（1）SDS處理樣品之后保證蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于分子量大小。操作時(shí)，首先應(yīng)保證SDS單體的濃度，當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，才能消除電荷的差異。還要注意加入還原劑如巰基乙醇，充分?jǐn)嚅_(kāi)二硫鍵，在SDS和還原劑共同作用下，使蛋白質(zhì)解聚成多肽鏈，隨后與SDS充分結(jié)合，消除結(jié)構(gòu)（形狀）差異。（2）電泳操作中一系列條件的控制。此處不再贅述。五、具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑儀器：垂直板電泳槽及附件、直流穩(wěn)壓電源（600V，100mA）、10mL注射器1支；微量進(jìn)樣器（100μl×1）；器具：微量可調(diào)手動(dòng)移液器；試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨、甘油、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸、鹽酸、乙酸、冰醋酸；材料：實(shí)驗(yàn)四麥清蛋白脫鹽樣品。

2.實(shí)驗(yàn)步驟[2]（1）電泳槽的安裝（10min）洗液浸泡玻璃板→熱水、餾水沖洗→干燥，裝入硅膠夾套，垂直固定于兩半槽之間（對(duì)角線螺旋依次擰緊）→高玻板一側(cè)注入2%的瓊脂（防漏膠）（2）制膠（30min）A.按照下表所示配制分離膠（T%=12.5%）名稱(chēng)分離膠緩沖液Acr/Bis儲(chǔ)備液dH2OTEMED過(guò)硫酸銨用量（ml）2.74.53.70.0050.2小燒杯中混勻立即灌膠（電泳槽微傾）→灌至距短玻璃片頂端2cm→放平電泳槽，立即用滴管覆蓋水層→界面二次出現(xiàn)時(shí)，靜置將水倒出（余下的水用濾紙片吸干）B.按照下表配制濃縮膠名稱(chēng)濃縮膠緩沖液Acr/Bis儲(chǔ)備液dH2OTEMED過(guò)硫酸銨用量（ml）1.250.753.00.0050.020混合均勻后立即灌膠，同分離膠灌至方法，灌至與矮玻板頂端相齊時(shí)，立即插入梳子。C.向電泳槽內(nèi)倒入電極緩沖液，短玻璃片一側(cè)沒(méi)過(guò)頂端，長(zhǎng)玻璃片沒(méi)過(guò)電極絲。小心拔梳子準(zhǔn)備點(diǎn)樣（3）樣品的處理（15min）Marker：市售標(biāo)準(zhǔn)樣品按要求處理；待測(cè)樣品：麥清蛋白初步提取的凝膠過(guò)濾脫鹽實(shí)驗(yàn)所獲峰值管制備的SDS樣品。將上述樣品均置于沸水浴中加熱5min，冷卻上樣（上樣量：Marker20μl；待測(cè)樣品梯度上樣，4μl、10μl、20μl、30μl、50μl）。（4）電泳（2.5h）取穩(wěn)流狀態(tài)，濃縮膠15mA，分離膠20mA（注意電壓）。特別注意溴酚藍(lán)前沿指示劑不能跑丟。（5）檢測(cè)（2.5h）取膠板置于水中浸泡10min→膠板置于染色液中加熱2h（通風(fēng)櫥）→脫色液脫色至條帶清楚→觀察結(jié)果。（6）測(cè)量蛋白質(zhì)分子的遷移率和未知樣品的分子量將溴酚藍(lán)遷移距離定為d1，蛋白質(zhì)遷移距離定為d2，根據(jù)下面公式計(jì)算各種蛋白質(zhì)的遷移率Rm：Rm=d以標(biāo)準(zhǔn)蛋白遷移率為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的分子量為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，得到一條直線。根據(jù)未知樣品的遷移率