流式細胞術(shù)（FCM）簡述流式細胞術(shù)（FlowCytometry）是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細胞儀對細胞等生物粒子的理化及生物學特性（細胞大小、DNA/RNA含量、細胞表面抗原表達等）進行定量、快速、客觀多參數(shù)相關(guān)檢測分析的新技術(shù)。它借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)與血球計數(shù)原理，同時利用熒光染料，激光技術(shù)，單抗技術(shù)以及計算機技術(shù)的發(fā)展，大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性，而且從同一個細胞中可以同時測得多種參數(shù)，為生物醫(yī)學與臨床檢驗學發(fā)展提供了一個全新的視角和強有力的手段。FCM在生命科學中的應用，標志著細胞生物學、腫瘤學、免疫學等進入了細胞和分子水平的研究。為從微觀認識細胞及橫向比較特征提供了精密、準確的方法和儀器。FCM的基本原理1、 流式細胞儀系統(tǒng)流程：標本T激光系統(tǒng)一流動系統(tǒng)T信號處理系統(tǒng)T放大系統(tǒng)T計算機系統(tǒng)T結(jié)果打印2、 基本原理：待測標本制備成單細胞懸液通過熒光染色后進入充滿鞘液的流動室，鞘液壓力與樣品流壓力是不同的，當二者的壓力差異達到一定程度時，鞘液裹挾著樣品流中細胞排成單列逐個經(jīng)過激光聚焦區(qū)。如果我們將細胞中感興趣的部分特異性的標上熒光染料，那麼這些染料將在細胞通過激光檢測區(qū)時受激光發(fā)出特定波長的熒光,通過一定波長選擇通透性的濾色片，我們可將不同波長的散射光、熒光信號區(qū)分開來，并送到不同的光電倍增管中，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理，我們就可以在計算機直觀的統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞各自的百分率。選擇不同的單克隆”＞克隆抗體及熒光染料，我們可以利用FC同時測定一個細胞上的多種不同特征；如果對具有某種特征的細胞有興趣，我們還可以利用流式的分選功能將其分選出來，以便進一步培養(yǎng)、研究。3、 意義：FCM與單克隆"＞克隆抗體結(jié)合，可對細胞表面和細胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體進行定量檢測，成為臨床檢驗與研究的重要指標。流式免疫熒光技術(shù)不僅能將表達位點的細胞群區(qū)分開來，而且還能進一步區(qū)分各細胞亞群。對免疫功能障礙、造血系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的研究、診斷、治療和預后評估都能起到重要作用應用分類1、免疫表型分析1993年在波士頓召開的人類白細胞分化抗原會議（leukocytedifferentiationantigen,HLDA）將CD抗原（clusterofdifferentiation）分為T細胞、B細胞、髓細胞、血小板、內(nèi)皮細胞、自然殺傷細胞、活化抗原、黏附因子、細胞因子和細胞因子受體等九個組，確立了48種新抗原。1996年11月在神戶召開的第六屆HLDA會議上，又有30多種新抗原被確認，CD編號已達166個，CD抗原有197種。2000年7月，第七屆人類白細胞分化抗原會議的召開，CD抗原已達247種。CD系列在免疫學中常被用于：（1）CD抗原的基因克隆”＞克隆，新CD抗原及新配體的發(fā)現(xiàn)；（2）CD抗原功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系；（3）細胞激活途徑和膜信號的傳遞；（4）細胞分化過程中的調(diào)控；（5）細胞亞群的功能。免疫表型分析的應用檢測淋巴細胞亞群，監(jiān)測細胞免疫狀態(tài)（淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)功能最重要的大細胞群，在免疫應答過程中，末梢血淋巴細胞發(fā)育分化成為功能不同的亞群。當亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，就能導致機體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化。FCM可以同時檢測一種或幾種淋巴細胞表面抗原，將不同的淋巴細胞亞群區(qū)分開來，并計算出它們相互間的比例，通過對病人淋巴細胞各亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，并指導治療）。白血病/淋巴瘤免疫分型；HLA組織配型及HLA與某些疾病的關(guān)系；干祖細胞的定量及成分分析；粘附分子;TCR多態(tài)性檢測;腫瘤癌基因及抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測;細胞內(nèi)酶；耐藥蛋白的分析等等；疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)；免疫調(diào)節(jié)：細胞因子/受體的相互作用、共刺激分子受體/配體的相互作用；發(fā)病機理：腫瘤的發(fā)病與機體的免疫力低下、以及信號傳遞障礙有關(guān)；藥物/疫苗效果的評價：腫瘤生物治療的時機選擇、以及效果的監(jiān)測；免疫狀態(tài)評價：移植、放化療等。流式細胞儀結(jié)構(gòu)與原理流式細胞儀是進行流式細胞分析的儀器，集電子、計算機、激光、流體理論于一體，被譽為試驗室的“CT”流式細胞術(shù)(FlowCytoMeter,FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，成為當代最先進的細胞定量分析技術(shù)。工作原理將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過A/D轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數(shù)目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電品體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。應用范圍用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學研究，并已開始用于細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和愛滋病感染者T4、T8細胞的記數(shù)。70年代以來，隨著流式細胞技術(shù)水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。流式細胞術(shù)已普遍應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫(yī)學和基礎(chǔ)醫(yī)學研究領(lǐng)域。技術(shù)特點流式細胞儀作為一種先進的細胞定量分析檢測儀器，設(shè)計上采用了許多獨特的技術(shù)，其中涉及到液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、信號測量和細胞分選等4個方面。展望流式細胞儀從細胞技術(shù)開始發(fā)展到今天，60至70年代是其飛速發(fā)展時期，激光技術(shù)、噴射技術(shù)以及計算機的應用使流式細胞儀在原理和結(jié)構(gòu)上形成了固定的模式。80年代則是流式細胞儀的商品化時期，這期間不斷有新型號的儀器推出，在多參數(shù)檢測技術(shù)上不斷提高。進入90年代，隨著微電子技術(shù)特別是計算機技術(shù)的發(fā)展，流式細胞儀的功能也越來越強大。在數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析方面有了長足進步。但是，在技術(shù)原理和設(shè)計方面并沒有突破性的進展。人們的注意力開始轉(zhuǎn)向流式細胞儀的應用，新的熒光探針