..激光掃描共聚焦顯微鏡吳旭2008.10.14高級顯微鏡原理正置、倒置顯微鏡細胞遺傳工作站活細胞工作站激光顯微別離系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡概述激光掃描共聚焦顯微鏡〔Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM〕生物醫(yī)學領域的主要應用通過一種或者多種熒光探針標記后，可對固定的組織或活體樣本進展亞細胞水平構造功能研究高空間分辨率、非介入無損傷連續(xù)光學切片、三維圖像、實時動態(tài)等細胞構造和功能的分析檢測……ConventionalfluorescencemicroscopeConfocalmicroscope歷史1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術的某些根本原理，獲得了美國的專利。1967年，Egger和Petran成功地應用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學橫斷面。1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關系和激光掃描器的拉曼光譜學。1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺商品化的共聚焦顯微鏡，型號為SOM-100，掃描方式為臺階式掃描。1986年MRC-500型改良為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)。ConfocalmicroscopyesofageJGWhite&WBAmos.Nature328,183-184(09July1987Zeiss、Leica、Meridian、OlympusZeissLSM510激光掃描共聚焦顯微鏡ZeissLSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡ZeissLSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡NikonA1R激光掃描共聚焦顯微鏡PrairieUltimaIV活體雙光子顯微鏡國家光電實驗室〔〕自制隨機定位雙光子顯微鏡LeicaTCSSP5激光共聚焦掃描顯微鏡根本原理相差、DIC常用熒光標記共聚焦原理Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy.Thestainedportionsofthecellin(Areducetheamplitudeoflightwavesofparticularwavelengthspassingthroughthem.Acoloredimageofthecellistherebyobtainedthatisvisibleintheordinaryway.Lightpassingthroughtheunstained,livingcell(Bundergoesverylittlechangeinamplitude,andthestructuraldetailscannotbeseeneveniftheimageishighlymagnified.Thephaseofthelight,however,isalteredbyitspassagethroughthecell,andsmallphasedifferencescanbemadevisiblebyexploitinginterferenceeffectsusingaphase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscope.D.Phase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscopeFourtypesoflightmicroscopy.(ATheimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.Theotherimageswereobtainedbytechniquesdiscussedinthetext:(Bphase-contrastmicroscopy,(CNomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy,and(Ddark-fieldmicroscopy.常用熒光探針ProteinsNucleicAcidsDNAIonspHSensitiveIndicatorsOxidationStatesSpecificOrganelles熒光顯微鏡原理明場：透射熒光：落射落射的優(yōu)點：物鏡的聚光鏡作用使視場均勻，發(fā)射光強度高。激發(fā)光損失小，熒光效應高。共聚焦原理由于pinhole的存在，使得局部雜散光〔虛線局部〕沒有被PMT探測器探測到，從而提高了成像效果。通過對樣品在x-y方向上的逐點掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)解焦平面在z方向的位置，連續(xù)掃描多個不同z位置的二維圖像，那么可以形成一個3D圖像，3D的重建需要軟件的支持。TheuniquescanningmoduleisthecoreoftheLSM510META.Itcontainsmotorizedcollimators,scanningmirrors,individuallyadjustableandpositionablepinholes,andhighlysensitivedetectorsincludingtheMETAdetector.Alltheseponentsarearrangedtoensureoptimumspecimenilluminationandefficientcollectionofreflectedoremittedlight.AhighlyefficientopticalgratingprovidesaninnovativewayofseparatingthefluorescenceemissionsintheMETAdetector.Thegratingprojectstheentirefluorescencespectrumontothe32channelsoftheMETAdetector.Thus,thespectralsignatureisacquiredforeachpixelofthescannedimageandsubsequentlycanbeusedforthedigitalseparationintoponentdyes.分光鏡組件構造共聚焦構成?光學顯微鏡?激光光源?掃描模塊〔包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡〕?光檢測器?計算機系統(tǒng)〔數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換應用〕?圖形輸出設備LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管圖像相關概念RGB三基色圖像數(shù)據(jù)位亮度比照度飽和分辯率怎樣得到樣品圖像樣品的標記物有適宜的激發(fā)波長和發(fā)射波長熒光下觀察選擇適宜的圖象設置激光掃描的通道參數(shù)設置圖象的屬性調(diào)節(jié)每一個通道的亮度、比照度、清晰度、背景亮度啟動共聚焦和CCD照片的比擬更大的動態(tài)圍高靈敏度圖像背景的消除靈活的拍照區(qū)域選擇ZOOM功能偽彩色環(huán)境要求高多通道圖象合成時間序列Ca離子成像FRAP：FluorescenceRedistributionAfterPhotobleachingFRAP是用來測定活細胞的動力學參數(shù)，借助于高強度脈沖激光來照射細胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光粹滅，該區(qū)域周圍的非粹