基因導入受體細胞基因導入受體細胞第1頁4.1受體細胞

受體細胞(receptorcell)又稱為宿主細胞或寄主細胞(hostcell)等，從試驗技術上講是能攝取外源DNA并使其穩定維持細胞；從試驗目標上講是有應用價值和理論研究價值細胞?；驅胧荏w細胞第2頁作為基因工程宿主細胞必須具備以下特征：便于重組DNA分子導入；能使重組DNA分子穩定存在于細胞中；便于重組體篩選；遺傳性穩定高，易于擴充培養或發酵生長；安全性高，無致病性，不會對外界環境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表示產物在細胞內積累，或促進外源基因高效分泌表示。在遺傳密碼應用上無顯著偏好性；含有很好翻譯后加工機制，便于真核目標基因高效表示；在理論研究和生產實踐上有較高應用價值。基因導入受體細胞第3頁基因工程中常見受體細胞類型：原核生物細胞真核生物細胞真菌細胞植物細胞昆蟲細胞動物細胞基因導入受體細胞第4頁原核生物細胞優點：大個別原核生物細胞無纖維素組成堅硬細胞壁，便于外源DNA進入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合蛋白質，為外源DNA與裸露染色體DNA重組降低了麻煩。原核生物多為單細胞生物，輕易取得一致性試驗材料，而且培養簡單，繁殖快速，試驗周期短，重復試驗快?；蚪M小，遺傳背景簡單，而且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入外源基因進行遺傳分析?；驅胧荏w細胞第5頁缺點：原核生物細胞不具備真核生物蛋白質折疊復性系統，即使真核生物基因能得到表示，得到多是無特異性空間結構多肽鏈。原核生物細胞缺乏真核生物蛋白質加工系統，而許多真核生物蛋白質生物活性正是依賴于其側鏈糖基化或磷酸化等修飾作用。原核細胞內源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表示產物不穩定?；驅胧荏w細胞第6頁至今被用作受體菌原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌等。一、大腸桿菌受體細胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是當前為止研究得最為詳盡、應用最為廣泛原核生物種類之一，也是基因工程研究和應用中發展最為完善和成熟載體受體系統。優點：繁殖快速、培養簡便，代謝易于控制。缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量內毒素，可造成人體熱原反應?；驅胧荏w細胞第7頁二、枯草桿菌受體細胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優點：枯草桿菌含有胞外酶分泌－調整基因，能將含有表示產物高效分泌到培養基中，大大簡化了蛋白表示產物提取和加工處理等，而且在大多數情況下，真核生物異源重組蛋白經枯草桿菌分泌后便含有天然構象和生物活性?？莶輻U菌不產生內毒素，無致病性，是一個安全基因工程菌?？莶輻U菌含有芽孢形成能力，易于保留和培養。枯草桿菌也含有大腸桿菌生長快速、代謝易于調控、分子遺傳學背景清楚等優點。應用：已成功用于表示人β干擾素、白細胞介素、乙型肝炎病毒關鍵抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等?；驅胧荏w細胞第8頁三、藍細菌（藍藻）藍藻——又稱藍綠藻或藍細菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，含有光合系統Ⅰ(PSⅠ)

和光合系統Ⅱ(PSⅡ)、能進行光合作用，但它又含有細菌特征，無細胞核及雙層膜結構細胞器，染色體裸露，是一個經典原核生物。藍藻作為表示外源基因受體菌兼具微生物和植物優點，詳細表現在：基因組為原核型，除了裸露染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA檢測。細胞壁屬G－，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA轉化。營光合自養生長，培養條件簡單，只需光、CO2、無機鹽、水和適宜溫度就能滿足生長需要。各種藍藻含內源質粒，為構建藍藻質粒載體提供了極好條件。藍藻富含蛋白質，而且多數藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎上采取轉基因技術，把一些主要藥品基因轉入無毒藍藻，就可到達錦上添花效果。基因導入受體細胞第9頁真核生物細胞一、真菌受體細胞真菌是低等真核生物，其基因結構、表示調控機制以及蛋白質加工與分泌都含有真核生物特征，所以利用真菌細胞表示高等動植物基因含有原核生物細胞無法比擬優點。酵母菌細胞是單細胞真核微生物，外源真核基因最理想表示系統。優點：酵母菌是結構最為簡單真核生物之一，其基因表示調控機理比較清楚，遺傳操作相對比較簡單。含有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統。不含有特異性病毒，不產生毒素。培養簡單，利于大規模發酵生產，成本低廉。能使外源基因表示產物分泌至培養基中，便于產物提取和加工。基因導入受體細胞第10頁二、植物受體細胞優點：全能性，即一個分離活細胞在適當培養條件下，較輕易再分化成植株，這意味著一個取得外源基因體細胞能夠培養出能穩定遺傳植株或品系。缺點：植物細胞有纖維素參加組成堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA分子?，F在用作轉基因受體植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經濟作物和擬南芥等模式植物?；驅胧荏w細胞第11頁三、動物受體細胞：優點：能識別和除去外源真核基因中內含子，剪切和加工成熟mRNA。真核基因表示蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產物含有很好蛋白質免疫原性，約為酵母細胞16～20倍。易被重組DNA質粒轉染，含有遺傳穩定性和可重復性。經轉化動物細胞可將表示產物分泌到培養基中，便于提純和加工，成本低。缺點：組織培養技術要求高，難度較大。當前用作基因轉移受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經濟動物和鼠、猴等試驗動物，主要用途在于大規模表示生產天然狀態復雜蛋白質或動物疫苗、動物品種遺傳改良及人類疾病基因治療等。常見動物受體細胞有小鼠L細胞、Hele細胞、猴腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等。以動物細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞優點。

基因導入受體細胞第12頁4.2.1重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌

轉化：重組質粒DNA分子經過與膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞內穩定維持和表示過程稱之為轉化。轉化現象最早是由Griffith于1928年在肺炎雙球菌中發覺。4.2重組DNA分子轉入原核生物細胞基因導入受體細胞第13頁目錄基因導入受體細胞第14頁細菌轉化本質是受體菌直接吸收來自供體菌游離DNA片段，即轉化因子，并在細胞中經過遺傳交換將之組合到本身基因組中，從而取得供體菌對應遺傳性狀過程?；驅胧荏w細胞第15頁以革蘭氏陽性細菌為例，細菌轉化一個可能機制包含以下基礎步驟：①細菌感受態形成。當轉化因子靠近細菌細胞時．受體細胞分泌一個小分子質量激活蛋白，又稱為感受因子，能誘導使細菌胞壁個別溶解，局部暴露出細胞膜上DNA結合蛋白和核酸酶等，此時細菌細胞處于感受態，極易接納周圍環境中轉化因子以實現轉化。基因導入受體細胞第16頁②轉化因子吸收。受體菌細胞膜上DNA結合蛋白可與轉化因子雙鏈DNA結構持異性結合，然后激活鄰近核酸酶，將雙鏈DNA分子中一條鏈逐步降解，同時將另一條鏈逐步轉移到受體菌內?；驅胧荏w細胞第17頁③整合復合物前體形成。進入受體細胞單鏈DNA與另一個游離蛋白因子結合，形成整合復合物前體，它能有效地保護單鏈DNA免受各種胞內核酸酶降解，并將其引導至受體菌染色體DNA處?；驅胧荏w細胞第18頁

④單鏈DNA轉化因子整合。整合復合物前體中單鏈DNA片段能夠經過同源重組，置換受體細胞染色體DNA同源區域．形成異源雜合雙鏈DNA結構。

基因導入受體細胞第19頁⑤轉化子形成。受體菌染色體組進行復制，雜合區段亦隨之進行半保留復制，當細胞分裂后，該染色體發生分離，形成一個新轉化子?；驅胧荏w細胞第20頁大腸桿菌是一個革蘭氏陰性菌，自然條件下極難進行轉化，其主要原因是轉化因子吸收較為困難。在基因工程研究和應用中，轉化受體菌細胞正是依據大家需要構建外源重組質粒DNA分子，而非來自供體菌游離DNA片段(轉化因子)。所以在大腸桿菌轉化試驗中，極少采取自然轉化方法，通常做法是首先采取人工方法制備感受態細胞，然后進行轉化處理，其中代表性方法之一是Ca2+誘導大腸桿菌轉化法?；驅胧荏w細胞第21頁（1）Ca2+誘導大腸桿菌轉化法Ca2+誘導DNA對大腸桿菌細胞轉化可能原因：①在0℃Cacl2低滲溶液中，細菌細胞發生膨脹，同時Cacl2使細胞膜磷脂層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中個別核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態。②Ca2+能與加入DNA分子結合，形成抗DNA酶(DNase)羥基-磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜外表面上。當42℃熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜液晶結構發生猛烈擾動，并隨之出現許多間隙，為DNA分子提供了進入細胞通道。基因導入受體細胞第22頁基因導入受體細胞第23頁該法重復性好。操作簡便快捷，適合用于成批制備感受態細胞。對這種感受態細胞進行轉化，每μg質粒DNA能夠取得5×106～2×l07個轉化茵落，完全能夠滿足質粒常規克隆需要?；驅胧荏w細胞第24頁Mg2+對DNA分子有很大穩定性作用，所以利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細胞，能夠提升DNA轉化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等深入處理細胞，能誘導高頻感受態細胞形成，轉化效率可提升100～1000倍，且對大小質粒分子均可進行有效轉化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常極少采取?；驅胧荏w細胞第25頁DNA分子進入大腸桿菌受體細胞機制

普通認為只有雙鏈閉環或開環質粒DNA分子才能轉化，而線形DNA分子不能取得轉化子。所以，環狀DNA分子中混雜線形DNA分子，會影響環狀DNA分子轉化效率。也有些人認為吸附在受體細胞表面上是雙鏈DNA，但卻以單鏈DNA進入細胞，這與革蘭氏陽性菌轉化過程相同?；驅胧荏w細胞第26頁轉化處理過程中，可能感染雜菌，造成假陽性轉化子出現，所以須設以下幾個對照處理：DNA對照處理。轉化處理液中用0.2ml無菌水代替0.2m1感受態細胞，檢驗DNA溶液是否染菌。感受態細胞對照處理。轉化處理液中用0.1mlNTE緩沖液代替0.1m1DNA溶液，檢驗感受態細胞是否染菌。感受態細胞有效性對照處理。在0.2ml感受態細胞中加入0.1ml已知輕易轉化這種感受態細胞質粒DNA?；驅胧荏w細胞第27頁（2）電穿孔轉化法基礎原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔(electroporation)．形成可逆瞬間通道，從而促進外源DNA有效吸收。電穿孔轉化法效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數影響，經過優化這些參數，每ugDNA能夠得到109－1010轉化子。研究表明，當電場強度和脈沖時間組合方式造成50％~70％細菌死亡時，轉化水平到達最高。

基因導入受體細胞第28頁用于電穿孔轉化法細胞處理要比感受態細胞制備輕易得多．當細菌生長到對數中期后給予冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液離子強度，并用10％甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3×l010個／m1。分裝，在干冰上速凍后置于－70℃貯存。這么，每小份細胞融解后即可用于轉化，使用期達6個月以上。電穿孔轉化須在低溫下(0－4℃)進行，轉化效率要比在室溫下操作提升約100倍。基因導入受體細胞第29頁（3）三親本雜交接合轉化大腸桿菌簡稱為三親本雜交轉移法，是基于非接合型質粒遷移作用而建立一個DNA轉化方式．適合用于那些難以采取Ca2+誘導轉化法或電穿孔法轉化受體菌。非接合型質粒分子較小，缺乏編碼質粒轉移體系所須全部基因，不能象接合型質粒那樣在宿主細胞間自我轉移。但假如在宿主細胞中存在另外一個溶合性接合型質粒（即輔助質粒），非接合型質粒通常也會被轉移，這種由共存接合型質粒引發非接合型質粒轉移過程稱為遷移作用。基因導入受體細胞第30頁接合型質粒分子較大，自我轉移隨意性強，轉移過程中經常伴伴隨宿主細胞染色體高頻轉移，所以難以作為基因工程載體使用。當前常見質粒載體多是在非接合型質?；蛉笔Я私雍限D移基因接合型質粒基礎上構建，故重組質粒DNA分子也不能直接接進行接合轉化．而只能經過其遷移作用來完成。基因導入受體細胞第31頁首先將含有接合轉化功效輔助質粒轉移至含有重組質粒供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使二者發生接合轉化作用，將重組質粒導入受體細胞。整個接合轉化過程包括到3種相關細菌菌株，即待轉化受體菌、含有要轉化重組質粒DNA供體菌和含有廣泛宿主輔助質粒輔助菌，所以稱為三親本雜交接合轉化法。基因導入受體細胞第32頁基因導入受體細胞第33頁（4）轉化率計算及其影響原因

轉化率是指DNA分子轉化受體菌取得轉化子效率，有兩種表示方式：一是以轉化子數與用于轉化處理DNA分子數或質量比率表示；二是以轉化子數與用于轉化處理受體細胞數比率表示。用每單位質量DNA分子取得轉化子數來表示，難以反應分子大小與轉化率之間關系。基因導入受體細胞第34頁以用于轉化處理受體細胞數為基數來計算轉化率，首先必須經過菌液OD值測定或細菌計數，計算出用于制備感受態細胞受體菌總數。然后計算轉化子與受體菌比率?；驅胧荏w細胞第35頁影響轉化率原因分子質量較小重組質粒DNA分子轉化率較高，分子質量較大重組質粒DNA分子轉化率較低，對于大于30kb重組質粒則極難進行轉化。組成重組DNA分子載體類型及其構型。與受體細胞親和性較強質粒載體轉化率要高于親和性較弱質粒載體，而處于自然雙螺旋閉環結構質粒載體比開環結組成線性結構質粒載體有更高轉化率。經體外酶切、酶連操作后載體DNA或重組DNA分子因為空間構象難以恢復，轉化率普通要比含有超螺旋結構質粒低兩個數量級。重組DNA分子濃度和純度。在10ng／100u1以下DNA濃度范圍內，轉化效率與DNA分子數成正比關系?；驅胧荏w細胞第36頁同一重組質粒DNA分子轉化不一樣受體菌細胞，轉化率不一樣——受體細胞選擇對于重組DNA分子轉化也是極為主要。前述三種轉化方法中，最正確轉化率以電穿孔法最高（108~1010）；Ca2+誘導轉化法居中（107~108）；而三親本雜交轉移法最低（104~105），但它適于前兩種方法難以轉化受體菌?；驅胧荏w細胞第37頁在轉化操作方而，受體細胞預處理或感受態細胞制備對轉化率影響最大。如Ca2+誘導大腸桿菌轉化法，菌齡、Cacl2處理時間、感受態細胞保留期以及熱激時間均是主要影響原因。電穿孔轉化法中，對受體細胞進行冰凍甘油預處理后轉化率，要比不經此預處理轉化率高10~100倍。

基因導入受體細胞第38頁5.2.2重組λ噬菌體DNA分子轉導大腸桿菌

將重組λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞中過程，稱為轉染。將重組λ噬菌體DNA分子導入大腸桿菌受體細胞常規方法是轉導操作。轉導(transduction)是指經過λ噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細胞路徑把外源DNA分子轉移到受體細胞內過程?；驅胧荏w細胞第39頁含有感染能力λ噬菌體顆粒除含有λ噬菌體DNA分子外，還包含外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重組A噬菌體DNA分子進行體外包裝。體外包裝，是指在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細胞內發生一系列特殊包裝反應過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝為成熟含有感染能力λ噬菌體顆粒技術?；驅胧荏w細胞第40頁基礎原理，依據λ噬菌體DNA體內包裝路徑，分別取得缺失D包裝蛋白λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白λ噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝λ噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白包裝物(含D蛋白)，二者混合后就能包裝λ噬菌體DNA。基因導入受體細胞第41頁λ噬菌體DNA體外包裝主要過程①制備包裝物。首先，須培養兩種溶原菌第二，誘導溶菌生長第三，搜集和貯存包裝物。②體外包裝。制備λ噬菌體DNA混合液。第一次包裝。包裝物剛融化時，細胞發生破裂，釋放出包裝物可馬上用于包裝。第二次包裝。進行第二次包裝，可提升包裝效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包裝反應液黏度，便于包裝反應進行。去除細胞屑。第二次包裝后，在反應液中加入SM溶液和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活噬菌體顆粒?；驅胧荏w細胞第42頁經過體外包裝噬菌體顆粒能夠感染適當受體菌細胞，并將重組λ噬菌體DNA分子高效導入細胞中。在良好體外包裝反應條件下，每μg野生型λ噬菌體DNA可形成108～109pfu。對于重組λ噬菌體DNA，包裝后成斑率要比野生型有所下降，但仍可到達106～107pfu，完全能夠滿足構建真核基因組基因文庫要求。基因導入受體細胞第43頁5.2.3受體細胞選擇

野生型大腸桿菌不是理想受體細胞，因為本身含有限制和修飾系統，另外還可能存在潛在致病性。所以必須經過適當誘變伎倆對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以取得適宜作為受體細胞突變菌株。通常應從以下幾個方面加以考慮：基因導入受體細胞第44頁①限制與修飾系統這是造成外源重組DNA轉化或轉導效率低下主要原因之一。應選取限制系統缺點型突變菌株作為受體細胞，以提升外源DNA分子轉化或轉導效率。深入使修飾系統也發生缺點，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子各種基因操作?；驅胧荏w細胞第45頁②重組系統

進入野生型細胞外源DNA分子能自發地與染色體DNA發生體內同源重組反應由rec基因家族編碼產物所控制。RecA蛋白能促進DNA分子之間同源聯會和DNA單鏈交換，recA基因突變使大腸桿菌細胞內遺傳重組頻率降低至10-6。recB、recC和recD基因突變也能夠降低遺傳重組發生頻率。所以受體細胞必須選擇體內同源重組缺點型遺傳表型，基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活?；驅胧荏w細胞第46頁③易于轉化或轉導能夠利用遺傳誘變技術改變受體菌細胞壁通透性及細胞膜特異吸附性，從而提升其轉化效率。還能夠選擇能夠誘導形成感受態細胞菌株作為受體菌細胞．基因導入受體細胞第47頁④有顯著選擇性差異遺傳表型差異大，可便于重組子檢測。通常是使受體細胞展現與載體所攜帶選擇標識互補遺傳性狀。如在大腸桿菌系統中，重組質粒載體上多含有AMP抗性標識基因，則所選取受體細胞應對這種抗生素敏感。當重組DNA分子轉入受體細胞后，載體上標識基因賦予受體細胞抗生素抗性特征，據此能夠區分轉化子與非轉化子。假如受體細胞含有與外源基因表示產物活性互補遺傳特征．能夠直接篩選到外源基因表示轉化細胞?；驅胧荏w細胞第48頁⑤感染寄生缺點型從安全角度上考慮，受體細胞不能含有感染寄生性?；驅胧荏w細胞第49頁5.2.4重組DNA分子轉入真核細胞5.2.4.1重組DNA分子導入植物細胞（1）農桿菌介導Ti質粒載體轉化法農桿菌是一類土壤習居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，對絕大多數單子葉植物無侵染能力。含有趨化性農桿菌移向這類植物受傷細胞，并將其Ti質粒上T-DNA轉移至細胞內部。依據這一性質，將待轉移目標基因組入Ti質粒載體，經過農桿菌介導進入植物細胞，與染色體DNA整合，得以穩定維持或表示?；驅胧荏w細胞第50頁用于植物基因轉化操作受體通常稱為外植體。選擇適宜外植體是成功進行遺傳轉化首要條件，而外植體選擇主要是依據受體細胞轉化能力來決定。當前作為基因轉化外植體材料非常廣泛，包括到植物各個組織、器官和部位?；驅胧荏w細胞第51頁選擇適當轉化外植體①優先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材料。②要注意外植體年紀，應選擇轉化能力較強幼期外植體，同時還要考慮其最正確感受態時期。③轉化外植體易于組織培養，并有較強再生能力。④應考慮外植體中易被轉化分生組織感受態細胞所在部位及其數量。切割外植體時應盡可能地暴露分生組織細胞，增加農桿茵與分生組織接種面積?；驅胧荏w細胞第52頁農桿菌接種操作

外植體農桿菌接種就是把農桿菌接種到外植體損傷切面。通常采取較低菌液OD值和較短浸泡時間來進行外植體接種。將接種農桿菌后外植體培養在誘導愈傷組織或不定芽固體分化培養基上，伴隨外植體細胞分裂和生長，農桿菌在外植體切口面也進行著增殖生長，故該培養過程稱之為農桿菌與外植體共培養。因為農桿菌附著侵染、T-DNA轉移及整合都是在共培養時期內完成，所以共培養技術條件掌握是整個轉化關鍵步驟。其中共培養時間對轉化率有著很大影響，基因導入受體細胞第53頁與農桿菌共培養后外植體表面及淺層組織中經常共生有大量農桿菌，對外植體正常生長會產生不利影響，必須進行脫菌培養以殺死和抑制農桿菌生長。脫菌培養是指把共培養后外植體轉移到含有抗生素培養基上繼續培養生長過程。當前使用最多是頭孢霉素。最終，還須將外植體轉移至篩選培養基上繼續培養，篩選出被轉化細胞，經再分化培養成再生植株?；驅胧荏w細胞第54頁針對不一樣外植體以及不一樣轉化目標而建立各種轉化方法，主要包含葉盤轉化法、植株接種共轉化法、植物愈傷組織共培養轉化法、植物懸浮細胞共培養轉化法和原生質體共培養轉化法等?；驅胧荏w細胞第55頁②整體植株接種轉化法：人為地在整體植株上造成創傷部位，然后把農桿菌接種在創傷表面，或用針頭把農桿菌注射到植株體內、使農桿菌按照天然感染過程在植株體內進行侵染，取得轉化植物愈傷組織或轉基因植株。基因導入受體細胞第56頁③原生質體共培養轉化法即取含重組Ti質粒農桿菌同剛才再生出新細胞壁原生質體作短暫共培養，促使農桿菌與植物細胞之間發生遺傳物質轉化。用此方法已成功地實現了植物細胞體外轉化。④懸浮細胞共培養轉化法。此方法類似于原生質體共培養轉化法，主要差異是首先建立懸浮細胞系?；驅胧荏w細胞第57頁(2)DNA直接轉移DNA直接轉移是指利用植物細胞生物學特件、經過物理化學方法將外源基因轉入受體植物細胞技術。為克服農桿菌介導法宿主不足，巳發展了電擊法(電穿孔法)、基因槍法(微彈轟擊法)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質體介導法，多聚物介導法、花粉管通導法等DNA直接轉移技術?；驅胧荏w細胞第58頁①多聚物介導法聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等是常見幫助基因轉移多聚物，尤以PEG應用最廣。這些多聚物和二價陽離子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)與DNA混合，能在原生質體表面形成沉淀顆粒，經過原生質體內否噬作用而被吸收進入細胞內?；驅胧荏w細胞第59頁聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等都是細胞融合劑。它們能夠使細胞膜之間或使DNA與膜形成份子橋，促使相互間接觸和粘連。還能夠引發膜表面電荷紊亂，干擾細胞間識別，從而有利于細胞膜間融合和外源DNA進入原生質體。本法中線性DNA比環形DNA有更高轉化效率，而單鏈DNA又比雙鏈DNA更為有效。這與質粒DNA分子對大腸桿菌細胞轉化完全相反?；驅胧荏w細胞第60頁②電穿孔轉化法細胞膜基礎成份是磷脂雙分子層，在適當外加電壓作用下，細胞膜有可能被擊穿，但不會造成細胞致命傷害，當移去外加電壓后，被擊穿膜孔可被修復?；驅胧荏w細胞第61頁③激光微束穿孔轉化法此方法是利用直徑很小，能量很高激光微束能引發細胞膜可逆性穿孔原理，在熒光顯微鏡下找出適當細胞，然后用激光光源替換熒光光源，聚焦后發出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍外源DNA分子隨之進入細胞。這種利用激光微束照射受體細胞實現外源DNA直接導入、整合和表示技術稱之為激光微束穿孔轉化法。激光微束穿孔轉化法優點：操作簡便快捷；基因轉移效率高；無宿主限制，可適合用于各種動植物細胞、組織、器官轉化操作，而且因為激光微束直徑小于細胞器，可對線粒體和葉綠體等細胞器進行基因操作。但該法需要昂貴儀器設備；技術條件要求高；穩定性和安全性等都不如電穿孔法和基因槍法?；驅胧荏w細胞第62頁④顯微注射法利用顯微注射儀，經過機械方法把外源DNA直接注入細胞質或細胞核基因轉化方法。這一技術關鍵是原生質體或具壁細胞或細胞團固定。因為動物細胞含有獨特貼壁生長待性，所以不存在固定細胞問題，這為動物細胞顯微注射創造了十分有利條件，也是動物細胞能廣泛使用該技術原因之一。不過，對植物細胞而言，首先必須建立固定細胞技術，然后才能進行定位顯微注射操作?；驅胧荏w細胞第63頁⑤超聲波介導轉化法利用低音強脈沖超聲波物理作用，可逆性地擊穿細胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進入細胞。利用超聲波處理能夠防止脈沖高電壓對細胞損傷作用，有利于原生質體存話，是一個有潛力轉化路徑。基因導入受體細胞第64頁⑥基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用高速運行金屬顆粒轟擊細胞時能進入細胞內現象，將包裹在金屬顆粒（鎢或金顆粒）表面外源DNA分子隨之帶入細胞進行表示基因轉化方法?；驅胧荏w細胞第65頁⑦脂質體介導法脂質體是由人工構建磷脂雙分子層組成膜狀結構，能夠將DNA包在其內，并經過脂質體與原生質體融合或因為原生質體吞噬過程，把外源DNA轉運到細胞內。優點是包在脂質體內DNA可免受細胞DNA酶降解?；驅胧荏w細胞第66頁⑧花粉管通道法將外源DNA涂于授粉枝頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織經過珠心進入胚囊，轉化還不具正