具有黃自溶活性的腺嘌吟營養缺陷型菌株的選育

目前，國外正在開發出一種新的祖母食品營養基金。食用營養酵母主要是在可食用酵母(如釀酒酵母、產朊假絲酵母、乳酸酵母)所含有的天然營養成分基礎上(其細胞內蛋白質、維生素及多種通過人體可同化的生物成分含量非常豐富,其氨基酸組成達到聯合國糧農組織(FAO)推薦的理想氨基酸組成值據我國營養狀況調查報告發現,中國人攝入的核黃素含量存在嚴重不足問題。核黃素又稱VB但現在研究核黃素的微生物發酵只限于制造胞外產品1材料和方法1.1材料表面1.1.1主試劑核黃素;腺嘌呤;25%Na1.1.2酵母ndidauntili面包酵母(Saccharomycescerevisiae)BY-1～8,假絲酵母(Candidautilis)CY-1～11,啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)SY-1～10,奶酒酵母(Saccharomycesuvarum)MY-1。以上菌種均為本實驗室保藏菌種。1.2實驗方法1.2.1酵母的制備從斜面接1環所測菌種于裝有50mLYEPD液體培養基的250mL三角瓶中,30℃振蕩培養24h。以10%的接種量轉接至裝有80mLYEPD的500mL三角瓶中,培養18h。取20mL發酵液,離心、洗滌,加入少量水(小于10mL),將酵母轉入100mL棕色容量瓶中,加0.1mL冰醋酸,沸水浴0.5h,稍冷倒入離心管,以3000r/min離心10min。將上清液倒入10mL棕色容量瓶中定容。用反相高效液相色譜鑒定1.2.2還原糖法斐林試劑定糖法1.2.3ph測量精密pH計測定。1.2.4果汁蛋白的制備從斜面取菌種1杯接入裝有80mLYEPD的500mL三角瓶中,30℃振蕩培養48h收集酵母,烘干后將干酵母與水以1:9的比例混合,攪拌均勻,調pH5.5,并加助溶劑即干重0.1%的硫胺素和5%的葡萄糖和0.03%的木瓜蛋白酶(酶活力為95×101.2.5強制改變方法甲基磺酸乙酯(EMS)誘變處理1.2.6腺預防缺陷型菌株的篩選為切斷核黃素進一步向腺嘌呤合成的代謝途徑,解除支路代謝的反饋抑制,將出發菌株進行EMS誘變,用逐個挑選法按一定排列順序分別對應點接于基本培養基和加有1g/L腺嘌呤的限制性培養基上,培養一定時間后,在限制性培養基上出現菌株,而在基本培養基相應位置卻沒有菌落生長。那該菌株可能是腺嘌呤缺陷型。將其挑入完全培養基中待測1.2.7腺嘌呤培養基的生長將所得到的合適的缺陷型菌株,再次進行誘變,將所得菌落分別點接于基本培養基和加有1g/L腺嘌呤的限制性培養基中,培養一定時間后,如果在限制性培養基上不生長,而在基本培養基相應位置卻有菌落生長。該菌株可能是所要的回復突變株通過回復突變,一方面使有關合成腺嘌呤的酶系恢復了活性;另一方面使反饋抑制得到解除。1.2.8復突變株誘變為得到對無機氮源的不敏感菌株,進一步對回復突變株進行誘變。將誘變菌種涂布于所確定的銨離子臨界濃度平板,培養一定的時間,挑選長得較大的菌落于YEPD完全培養基斜面待測1.3培養基1.3.1表面活性劑麥芽汁固體培養基,糖度12Brix,pH自然。1.3.2基本母系培養基葡萄糖20g/L,生物素20mg/L,(NH1.3.3yepd固體完全培養YEPD液體完全培養基加2%瓊脂。1.3.4無氮基培養酵母基本培養基不加氮源。1.3.5二倍氮基本培養基在無氮基本培養基中加入2倍氮源,即(NH1.3.6限制基本功能基本培養基加上0.1%腺嘌呤。1.3.7發酵培養基葡萄糖5%,磷酸二氫鉀0.02%,MgSO2結果與討論2.1出發菌株的篩選對現有啤酒酵母(Saccharomycescarlsbergensis)SY-1～10、面包酵母(Saccharomycescerevisiae)BY-1～8、產朊假絲酵母(Candidautilis)CY～11和奶酒酵母(SaccharomycesuvarumMY-1,從核黃素和浸出物比率兩項指標進行測定,挑選適宜的菌株為出發菌株。下面菌種在挑選指標上比同類菌株優越,現相互之間進行比較,結果如表1。從對BY-2,MY-1,CY-11,SY-3四種不同酵母的測定結果來看,MY-1菌株核黃素和自溶浸出率均為最高,是較為理想的出發菌株。2.2最佳菌株的確定為切斷核黃素進一步向腺嘌呤合成的代謝途徑,按照1.2.5方法進行誘變,挑得48株腺嘌呤缺陷型菌株,分別劃斜面保存。以MY-1作為對照,分別測定測定核黃素含量,選出核黃素含量明顯高于出發菌株MY-1的3株:M1-1、M1-3、M1-5,進一步測定其穩定性。結果如表2。從表2可以看出,誘變菌株M-3核黃素含量為162.01mg/kg,細胞生物量為14.038(g/L)。核黃素含量高于出發菌株MY-1約65.25%,且傳代測定結果穩定。細胞生物量比出發菌株略低,但綜合考慮確定M-3菌為進一步誘變的出發菌株。2.3胰腺磷酸酶回復突變植物的篩選2.4抗銨菌株的確定腺嘌呤缺陷型的回復突變株對無機氮源(銨鹽)比較敏感,不利于工業生產。為了減少突變株對銨離子的敏感性,將回復突變株M2-8菌進一步誘變,涂布于臨界濃度平板,得到抗銨菌株。初步測定得到4株核黃素含量較高的菌株,依次編號M3-17、M3-18、M3-19、M3-20。以M2-8號樣為對照樣,測定核黃素含量,結果如表4,由表可以看出,M3-20菌核黃素含量最高,比進一步誘變出發菌株M2-8核黃素含量高92.57%。因此,以核黃素含量為主要指標,確定M3-20為我們所篩選的目的菌株。2.5可靠性研究3突變株的確定(1)通過甲基磺酸乙酯誘變酵母菌種,能有效的提高酵母胞內核黃素的積累,突變株的核黃素含量與出發菌株相比提高了約215%。(2)選育的突變株能有效的在以銨鹽為氮源合成培養基上生長,且遺傳穩定性較好,適合工業化生產食用營養酵母。腺嘌呤缺陷型必須在含有一定腺嘌呤的培養基內才能生長,這對于大規模的工業生產不利。因此需培育腺嘌呤缺陷型的回復突變株。于是對M1-3菌株進一步誘變,挑選得到12株突變株依次編號M2-1、M2-2、……M2-12。對上述1