生物學做Westernblot儀器第1頁/共50頁化學顯色法操作簡便，無需暗房和顯影設備，顯色直觀，但靈敏度較低，國外已不常見。化學發光法（ECL）比化學顯色法靈敏度高，可達pg水平。但由于是酶促反應，不同曝光時間得到的信號與樣品量不成線性關系，不能做準確定量。熒光法采用熒光檢測原理，操作簡單，熒光信號強弱直接反映目的蛋白量，可進行精確定量；還可以根據熒光染料的不同，用不同的熒光二抗可以在同一張膜上同時檢測兩種蛋白質。第2頁/共50頁不同檢測方法特點ECL常見問題第3頁/共50頁暗房操作麻煩，曝光時間難以控制，無法準確定量背景高，高濃度蛋白易出現“吹泡”現象檢測兩種蛋白時，需要Stripping和Re-probe，操作復雜膠片上無法直接觀察到Marker解決方案：Odyssey第4頁/共50頁熒光紅外雙色Odyssey

VS

ECL流程酶紅外染料第5頁/共50頁熒光直接檢測INFRAREDLASERDIODEINFRAREDAPDDETECTOR信號持久第6頁/共50頁不需要底物不需要底片/暗室熒光－準確定量TIMETIMECHEMILUMINESCENCE動態信號－信號隨時間變化信號不與目標蛋白濃度成比例關系ODYSSEY靜態信號－信號不隨時間變化信號和目標蛋白濃度成比例關系High

concentration

/signalMedium

concentration

/signalLow

concentration

/signalSaturationBackground0,00,0INTENSITY第7頁/共50頁紅外熒光VS化學發光第8頁/共50頁量線ECLODYSSEYOdyssey系統定量的線性相關性倍比稀釋的IRDye

800-標記的抗體.R2

從1.5

ngto

0.8pg是0.99996,極佳的線性相關性。極佳的線性相關性增加了定量的準確性1.5

ng0.8

pg第9頁/共50頁Dilutions

of

transferrin

detected

with

rabbit

anti-Tf

primary

andAlexa

Fluor

680

goat

anti-rabbit

secondary.第10頁/共50頁BioTechniques

29:636-642)紅外熒光

VS 化學發光紅外熒光VS化學發光成

效第11頁/共50頁紅外+熒光

DEMO第12頁/共50頁實驗目的實驗步驟結論10:4:2:1稀釋第13頁/共50頁紅外技術優點—低背景VisibleFluorophoresPAHs

PorphyrinsBiomolecules

NIR

Dyes1000

nm800600400200All

othersequencers400-650

nmLI-COR700

-

800

nm第14頁/共50頁紅外熒光vs可見熒光膜第15頁/共50頁背景更低，信噪比高，保證更好檢測靈敏度定量線性范圍更寬，可達4個數量級，定量更準確穿透力更強（活體成像的應用）第16頁/共50頁紅外熒光優點Odyssey—雙色同時檢測800

nm700

nmOverlay兩套獨立激發檢測系統第17頁/共50頁靶蛋白+靶蛋白

核酸+結合蛋白

Marker+總蛋白

參比蛋白+靶蛋白總蛋白+修飾化蛋白Odyssey雙色應用第18頁/共50頁雙通道同時檢測第19頁/共50頁雙色－ERK蛋白的磷酸化Anti-EGFR

and

anti-phospho-EGFR

antibody

specificity

inA431

cellsThe

mobility

shift

caused

byphosphorylation

is

visible

(A)

asindicated

by

the

red

bands

above

theyellow

bands.

(yellow

indicatesoverlapping

red

and

green

signals).Single

color

images

(B

and

C)

can

be

overlaid

(A)

to

showboth

total

protein

and

phosphorylated

protein.第20頁/共50頁雙色－EMSADNA-Protein

ComplexUnbound

DNA

IRDye

800ound

DNA

IRDye

700第21頁/共50頁Odyssey雙色檢測的優越性第22頁/共50頁雙色輸出，兩個目標基因同時檢測，減少了工作量，而且雜交條件均等，便于兩個數據的對比雜交結果對比輸出，結論更加直觀，一目了然可進行準確的量化分析In-Cell

Western

AssayThe

Odyssey

In-Cell

Western

(ICW)

Assayis

a

high-throughput

approach

tosimultaneously

detect

and

quantify

twoseparate

proteins

directly

within

cells.第23頁/共50頁In-Cell

Western

Assay第24頁/共50頁細

Cul e

c

96-wellll

ateIncubate

with

IRDye?

secondary

antibodies(e.g.:

IRDye?

680

and

IRDye?

800CW)Incubate

with

2

primary

antibodiesIncubate

with

1

primary

antibodyIncubate

with

IRDye?

secondary

antibody

anda

DNA

stain

(e.g.:

To-Pro-3)In-Cell

Western工作流程第25頁/共50頁Membrane

Westerns

vs

ICW第26頁/共50頁EGF對ERK磷酸化水平的調控%第27頁/共50頁EGF抑制劑對ERK磷酸化水平的影響第28頁/共50頁In-Cell

Western軟件模塊第29頁/共50頁在用客戶提供的結果第30頁/共50頁Odyssey

ICW的優點第31頁/共50頁高速與普通膜雜交相比，通量提高30倍ICW軟件提供便捷的計算和分析準確紅外檢測提供最準確的量化結果。避免在細胞裂解等步驟中蛋白的損失。操作簡單操作步驟簡單ICW試劑第32頁/共50頁其他經ICW驗證的抗體以及kit第33頁/共50頁應用文獻一第34頁/共50頁RasRafMekERKJAKSTAT1STAT3Grb2SOSRAS/RAF/Mek/ERK信號通路KSR1第35頁/共50頁第36頁/共50頁左圖：The

effect

of

KSR1

phosphorylationon

MEK1/2

and

RSK1

activation.上圖：Mutation

of

KSR1

phosphorylationsites

enhances

the

duration

of

ERKac第ct3i7v頁a/t共i5o0n頁.應用

獻二第38頁/共50頁第39頁/共50頁第40頁/共50頁蛋白

芯片掃描CST

PathScan

RTKSignaling

antibody

arraykit(7949)kit包括：所有的輔助產品和試劑R&D

4種適合Licor檢測試劑盒第41頁/共50頁小動物活體成像-雙色第42頁/共50頁小動物活體成像-附件第43頁/共50頁軟件功能儀器軟件AdministrationDiagnostics應用軟件圖象控制背景扣除條帶發現和定位定量ICW%結果計算(includingnormalization)小動物活體分析第44頁/共50頁第45頁/共50頁Odyssey系統發表文獻統計第46頁/共50頁Paper

List第47頁/共50頁Nagashima,,

K.,

et

al.Genetic

and

pharmacological

inhibition

of

PDK1

in

cancer

cells

characterization

of

aselective

allosteric

kinase

inhibitorJ.

Biol.

Chem

286:6433

(2011)Sneeringer,

C.J.,

et

al.Coordinated

activities

of

wild-type

plus

mutant

EZH2

drive

tumor-associatedhypertrimethylation

of

lysine

27

on

histone

H3

(H3K27)

in

human

B-cell

lymphomasPNAS

107:20980

(2010)Cittelly,

D.

M.,

et

al.Oncogenic

HER2D16

suppresses

miR-15a/16

and

deregulates

BCL-2

to

promoteendocrine

resistance

of

breast

tumorsCarcinogenesis

31:2049

(2010)Pan,

Y.

et

al.Sprouty2-modulated

Kras

signaling

rescues

Shp2

deficiency

during

lens

and

lacrimalglad

development.Development

137,

1085-1093

(2010)Markovic,

D

et

al.Intracellular

mechanisms

regulating

corticotropin-releasing

hormone

receptor-2betaendocytosis

and

interaction

with

extracellularly

regulated

kinase

1/2

and

p38mitogen-activated

protein

kinase

signaling

cascades.

Mol

Endocrinol.

22(3):

689-706

(2008)總結第48頁/共50頁準確定量—提供更完善的數據，提升文章檔次成像效果好—背景低，條帶清晰，沒有吹泡現象雙色檢測—靶蛋白+總蛋白+Maker

同時檢測成本低—無需底物，無需膠片，無需暗室，二抗稀釋倍數高擴展應用—ICW