Picbio三代測序原理RevisedbyChenZhenin2021三代測序之PacBiOSMRT技術全解析2017-05-1111:29來源:氣溫回升，天氣漸暖，花兒開了一簇又一簇~在這美好的季節里，我們準備聊點新話題。今天小編要來和你分享：PacBioSMRT測序那些事兒~測序技術在近幾年中又有里程碑的發展，PacificBiosciences公司成功推出商業化的第三代測序儀平臺，讓三代測序正式走入我們的視線。與前兩代相比，第三代測序有什么不同呢？今天小編帶大家詳細了解測序界新寵-PaCBiOSMRT測序平臺。PacBioSMRT測序原理PacificBiOSCienCeS公司研發的單分子實時測序系統(SingleMoleculeRealTime，SMRT)應用了邊合成邊測序的原理，并以SMRT芯片為測序載體。基本原理如下：聚合酶捕獲文庫DNA序列，錨定在零模波導孔底部4種不同熒光標記的dNTP隨機進入零模波導孔底部熒光dNTP被激光照射，發出熒光，檢測熒光熒光dNTP與DNA模板的堿基匹配，在酶的作用下合成一個堿基統計熒光信號存在時間長短，區分匹配堿基與游離堿基，獲得DNA序列酶反應過程中，一方面使鏈延伸，另一方面使dNTP上的熒光基團脫落聚合反應持續進行，測序同時持續進行PacBioSMRT測序原理PacBioSMRT的單分子測序和超長讀長是如何實現的？我們重點看一下該技術的兩點關鍵創新：分別是零模波導孔(zero-modewaveguides,ZMWS)和熒光標記在核苷酸焦磷酸鏈上(Phospholinkednucleotides)。SMRTCen含有納米級的零模波導孔，每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序，并實時檢測插入堿基的熒光信號。ZMW是一個直徑只有10~50nm的孔，當激光打在ZMW底部時，只能照亮很小的區域，DNA聚合酶就被固定在這個區域。只有在這個區域內，堿基攜帶的熒光基團被激活從而被檢測到，大幅地降低了背景熒光干擾。SMRTCen和ZMWS將熒光染料標記在核苷酸的磷酸鏈而不是堿基上，當核苷酸摻入到新生的鏈中，標記基團就會自動脫落，減少了DNA合成的空間位阻，維持DNA鏈連續合成，延長了測序讀長。SMRT測序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然狀態的聚合酶反應體系。熒光標記在焦磷酸鏈上的核苷酸PaCBioSMRT測序送樣要求PaCBioSMRT測序建庫流程DNA打斷之后，經過末端修復、接頭連接、片段篩選、雜交測序引物和聚合酶綁定，即可出庫準備上機測序，建庫過程無PCR反應。PacBioSMRT建庫流程PacBioSMRT技術特點PacBioSMRT技術有兩種測序平臺，RSn和SeqUel，應該如何選擇？小編已將二者的對比表準備好啦~表3RSn和SeqUel測序平臺比較Sequel平臺與RSII平臺相比具有很大的優勢，Sequel平臺測序通量高、單Gb數據成本低、周期短。1.第三代基因測序技術又被為"SingleMoleculeRealTime(SMRT)DNASequencing"(單分子實時DNA測序技術)，該方法基于納米孔的單分子讀取技術，不需要擴增即可快速讀取序列。目前，PacificBiosciences公司已經成功推出了商業化的第三代測序儀PacBioRS平臺，使得第三代測序正式走入人們的視角。PacBioRSII是PaCifiCBiosciences公司研發的單分子實時測序系統(SingleMoleculeRealTime,SMRT)，其專利的SMRTCen含有15,000個納米級的零模波導孔(zero-modewaveguides,ZMWs)，每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序，并實時檢測插入堿基的熒光信號。技術特點蔓?利用測序過程聚合酶反應的動力學變化，首次實現對堿基修飾進行直接測序。蔓?超長的讀長：平均測序讀長能達到7,000-8,000bp,最長讀長能達到3,0000bp；蔓?準確率高：對基因組組裝和基因組變異檢測，可以最多達到99.999%的準確率；蔓?敏感性強：可以檢測頻率在0.1%的minorvariants；U?無PCR擴增偏好性：樣本不需要進行PCR擴增，避免了覆蓋度不均一和PCRartifacts；U?最小的GC偏好性(GCbias)：在極端高GC和極端低GC區域，可以輕松測定，從而保證序列的均勻覆蓋度。3數據產出試劑盒 平均讀長數據量/SMRTCenP4-C2Chemistry5.5-6Kb ~200MbP5-C3Chemistry8-10Kb ~250Mb4應用領域(1)全基因組denovo測序與二代測序最高不超過1kb的讀長相比，PacBioRSII的長讀長將有效解決短序列數據的拼接難題。同時，與二代測序的模板樣品需要擴增相比，PacBioRSII無需擴增可直接對單個分子進行測序，有效避免了PCR擴增偏好性和GC偏好性，PacBioRSII可輕松跨越GC含量異常（過高或過低）及高度序列重復的區域，實現序列覆蓋的完整性和均一性。（2）基因組草圖的優化或基因組完成圖繪制對前期已開展測序的動植物、微生物基因組結合三代長讀長測序數據進行完善和提升。針對前期已經開展全基因組測序，獲得基因組草圖的動植物、微生物等，可以結合PacBioRSII平臺長讀長reads進行補充，從而快速獲得前期沒有測得的信息及提升基因組的完整度。另外還可以針對前期沒有檢測獲得的結構變異信息（StrUctUral-Variationevents）、串聯重復序列信息（tandemduplication）、易位信息（InVersion）等。尤其在微生物基因組完成圖的繪制中，可在一天之內、成本低于$1,000即可將基因組完善獲得0gapcontig。（3）全長轉錄本測序PacBioRSII的長讀長可實現全長轉錄本測序，并使基因可變剪接形式的識別成為可能，因此可以對新基因及其isoform進行更全面的研究。同時，長讀長不再需要對RNA-Seq的reads進行組裝，因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進行更全面的注釋，用以改進參考基因組中的基因注釋信息。（4）宏基因組測序長讀長reads能夠更為精準地鑒定水體、土壤、腸道等生境中微生物的種類的鑒定，能夠更加快捷地獲得更多微生物種的全基因組序列。（5）16SrDNA全長測序PacBioRSII的平均讀長為8T0Kb，而16SrDNA長度大約為1540bp，因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列。（6）細胞器基因組測序葉綠體基因組和線粒體基因組序列都包含重復序列、反向重復序列等復雜結構，PacBioRSII的長讀長可直接跨越這些區域獲得這些細胞器的全基因組序列信息等，基因組組裝不依賴于是否有近緣物種的線粒體和葉綠體基因組信息等、重測序能夠檢測到全面的SNPs及indel信息。（7）全基因組重測序&稀有變異鑒定PacBioRSII長讀長測序reads無GC偏號，能夠全面獲得基因組的遺傳變異，包括SNPs的鑒定到CNV、SV結構變異等，可運用至人類癌癥基因組重測序等。PacBioRSII平臺測序周期在10hours小時即可完成測序，可應用至需要快速反饋的臨床檢測中，如細菌感染疾病中細菌的鑒定、病毒的鑒定等，取樣開展重測序和目前已有的細菌、病毒基因組數據庫進行比對鑒定即可。（8）表觀遺傳學PacBioRSII利用測序過程聚合酶反應的動力學變化，首次實現對堿基修飾進行直接測序。當堿基有額外修飾時，DNA聚合酶的合成速度會減慢，對應的信號會被檢測出來。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的“停頓模式"PacBioRSII產生微小差異，最